ယၢမ်းလဵဝ် *တီႈယူႇယၢမ်းလဵဝ် - ဝဵင်းၶူဝ်ႇလူဝ်ႇၼီႇ 50931 မိူင်းၵျႃႇမၼီႇ ဝဵင်းၶူဝ်ႇလူဝ်ႇၼီႇ ၸုမ်းၶူၼ်ႉၶႂႃႉ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ လွင်ႈၶီၸႂ် သႄးလ် ၼႂ်းတၢင်းပဵၼ် ဢၼ်ၵဵဝ်ႇၵပ်း လွင်ႈဢႃႇယုယႂ်ႇ (CECAD)။
လွင်ႈဢဵၼ်ႁႅင်းလူႉလႅဝ် တၢင်းပဵၼ် mitochondrial ၼႆႉ လႆႈဝႃႈ ဢမ်ႇၸၢင်ႊၶိုၼ်းမႄးလႆႈ ယွၼ်ႉဝႃႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼႆႉ မၼ်းမီးလွင်ႈ မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ ၵူၺ်းၵႃႊ ၽွၼ်းယွၼ်ႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈ တေႃႇ သႄးလ် ဢၼ်ႁဵတ်းၵၢၼ် ႁင်းၶေႃၶေႃ တီႈတူဝ်ၶိင်းၼၼ်ႉ ဢမ်ႇပွင်ႇၸႂ်လႆႈလီ။ တီႈၼႆႈၼႆႉ ႁဝ်းၶႃႈ တေမိုတ်ႈၵိုဝ်းၸမ်ၸႂ်ပၼ် ပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ပဵၼ် သႄးလ် ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ Purkinje ဢၼ်မီး လွင်ႈႁၢမ်း OXPHOS ဢၼ်ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမႃး ယွၼ်ႉ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် လွင်ႈႁူမ်ႈႁွမ်း mitochondrial ဢၼ်ၵူၼ်ႇပင်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁဝ်းႁၼ်ဝႃႈ လွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈ ၶွင် mitochondrial ၼႆႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢၼ်လိုၵ်ႉလမ်ႇ ၼႂ်းတူင်ႇ ပရူဝ်ႇတိၼ်းၶဝ် ပဵၼ်မႃးသေ ၵမ်းလိုၼ်းမႃး ႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ၶၵ်ႉတွၼ်ႊ ၶွင် ပရူဝ်ႇၵရႅမ်ႇ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢၼ်တႅတ်ႈၼႅတ်ႈ မိူဝ်ႈတွမ်ႇတွမ်ႊၶဝ် ပႆႇတၢႆၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢမ်ႇထၢင်ႇသေ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈတႅပ်းတတ်း လွင်ႈဢၼ် ႁၼ်ၸႅင်ႈလီ လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ ပၢႆႇရူဝ်ႇဝႅတ်ႉ ၶႃႇပၢၵ်ႇသီႇလႅတ်ႉ (PCx) လႄႈ ပရူဝ်ႇဢွၵ်ႇသီႇတႅတ်ႉ တၢင်ႇၸိူဝ်း ဢၼ်ၵဵဝ်ႇၵပ်း လွင်ႈၽိူမ်ႉထႅမ် ၶူဝ်းၶွင် ၵၢင် ပၼ်ႇႁွပ်ႈ TCA ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈႁႄႉၵင်ႈ PCx ၼႆႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈၶီၸႂ် လႄႈ လွင်ႈဢဵၼ်ႁႅင်း လူႉလႅဝ်ၵႂႃႇၼၼ်ႉ ႁၢဝ်ႈႁႅင်းမႃးသေ ၼႄဝႃႈ တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅပ်ႈၼႆႉ မီးၽွၼ်းလီ တႃႇႁႄႉၵင်ႈ တီႈဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၶိုၼ်းမႄးၶိုၼ်း လွင်ႈႁူမ်ႈႁွမ်း mitochondrial တီႈၼႂ်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်လူႉလႅဝ်ၵႂႃႇ တီႈသုတ်းၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ပိူင်ၾၢင် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ၸိူဝ်းၼႆႉ ၶိုၼ်းလီမႃး တင်းမူတ်းသေ ႁႄႉၵင်ႈပၼ် လွင်ႈတွမ်ႇတွမ်ႊၶဝ် တၢႆၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၶူၼ်ႉႁၼ်ႁဝ်းၶႃႈၼႆႉ ၼႄပၼ် သဵၼ်ႈတၢင်းဢၼ်ဢမ်ႇႁူႉဝႆႉ မိူဝ်ႈဢွၼ်တၢင်း ဢၼ်ပၼ် လွင်ႈၶၢမ်ႇလႆႈ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ် ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ၶွင် mitochondrial လႄႈ ၼႄဝႃႈ လွင်ႈလူႉလႅဝ် ဢဵၼ်ႁႅင်းၼႆႉ ၸၢင်ႊၶိုၼ်းပဵၼ်မႃး ၼႂ်းၸၼ်ႉဝၢႆးလင် တၢင်းပဵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ပုၼ်ႈၽွၼ်း သုၼ်ၵၢင် ၶွင် mitochondria ဢၼ်ထိင်းသိမ်းလႆႈ လွင်ႈထၢတ်ႈ ဢဵၼ်ႁႅင်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼၼ်ႉ လႆႈဝႆႉၼၵ်းၼႃ လူၺ်ႈ ၾၢင်ႁၢင်ႊ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ၵႂၢင်ႈၶႂၢင် ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇတင်း တၢင်းပဵၼ် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၵူၼ်းႁဝ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တၢင်းပဵၼ်ၸိူဝ်းၼႆႉ ၵမ်ႈၼမ် ပဵၼ်ယွၼ်ႉ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ၸိူဝ်ႉၽၢၼ်း ဢၼ်ၵုမ်းထိင်း လွင်ႈၸိူဝ်ႉၽၼ်း ဢွၵ်းဢေႃ ဢွၵ်ႇမႃး (1, 2) ဢမ်ႇၼၼ် လွင်ႈယႃႉလူႉ ၸိူဝ်ႉၽၼ်း ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇတင်း လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ဢမ်ႇလႆႈ တုမ်ႉတိူဝ်ႉ လွင်ႈၼိမ်သဝ်း ၶွင် ဢွၵ်းဢေႃ DNA (mtDNA) (3, 4) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵၢၼ်ႁဵတ်းသၢင်ႈ တီႈတူဝ်သတ်းၼၼ်ႉ ၼႄဝႆႉဝႃႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇတေႃႇ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ်ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ၶွင် mitochondrial တီႈၼႂ်း တိတ်ႉသျူးႁိမ်းႁွမ်းၼၼ်ႉ သဵၼ်ႈတၢင်း ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ဢၼ်ၵဝ်ႇၵႄႇ (5-7) ၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊတူင်ႉၼိုင်လႆႈ၊ ယွၼ်ႉၼၼ် ပၼ်လွင်ႈႁူႉႁၼ် ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ ၼိူဝ်လွင်ႈပဵၼ်မႃး တၢင်းပဵၼ် ဢၼ်သုၵ်ႉသၢၵ်ႉၸိူဝ်းၼႆႉယဝ်ႉ။ ပေႃးမႃးၼိူင်းတူၺ်းၼႆ လွင်ႈပွင်ႇၸႂ်ႁဝ်းတေႃႇ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼႂ်းတွမ်ႇတွမ်ႊ ဢၼ်ပဵၼ်မႃး ယွၼ်ႉ ၵၢၼ်ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ဢွၵ်းဢေႃ mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) ၼႆႉ ပဵၼ်ပိုၼ်ႉထၢၼ်ႈ (8) သေ ဝႆႉၼၵ်းၼႃတေႃႇ လွင်ႈလူဝ်ႇ မၵ်းမၼ်ႈ ယိူင်းမၢႆ လၢႆးယူတ်းယႃ ဢၼ်တေၸၢင်ႊ ႁႄႉၵင်ႈ ဢမ်ႇၼၼ် ႁႄႉၵင်ႈ တၢင်းပဵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁႄႉၵင်ႈပၼ် လွင်ႈဢဵၼ်ႁႅင်းလူႉလႅဝ် (9)။ လွင်ႈဢၼ်ဢမ်ႇမီးၶေႃႈမုၼ်းၼၼ်ႉ ပဵၼ်လွင်ႈဢၼ်ဝႃႈ သႄးလ်ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇၼႆႉ ၵႂၢင်ႈၵႂၢင်ႈၶႂၢင်ၶႂၢင်ဝႃႈ မၼ်းမီးလွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ ႁႅင်းၼႃႇ ပေႃးမႃးၼိူင်းၵၼ်တင်း မဵဝ်းသႅၼ်းသႄးလ် ဢၼ်မီးႁိမ်းႁွမ်း တိတ်ႉသျူးၼၼ်ႉ (10)။ ပၼ်ဝႃႈ သႄးၸိူဝ်းၼႆႉ လဵၼ်ႈပဵၼ် ပုၼ်ႈၽွၼ်း သုၼ်ၵၢင် ၼႂ်းလွင်ႈ ၵပ်းသိုပ်ႇ လွင်ႈၵမ်ႉၸွႆႈ ထၢတ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ တီႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ တႃႇပၼ်ႁႅင်း လွင်ႈသူင်ႇၶၢဝ်ႇ synaptic လႄႈ တုမ်ႉတွပ်ႇတေႃႇ ငဝ်းလၢႆး လွင်ႈၸဵပ်းသႅပ်ႇ လႄႈ တၢင်းပဵၼ် ၸိူဝ်းၼႆႉ ၼမ်ႉၵတ်ႉ တႃႇတေ မူၼ်ႉမႄး လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ၼႂ်းသႄး ႁႂ်ႈမႅၼ်ႈၸွမ်း ငဝ်းလၢႆး ဢၼ်ၶဵင်ႇတႃႉ ၶွင် တိတ်ႉသျူး ဢွၵ်းဢေႃၼၼ်ႉ ၸမ်တေ မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ တီႈ သႄး glial (11-14) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လိူဝ်သေၼၼ်ႉ လွင်ႈတွမ်ႇတွမ်ႊ ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ၵၼ် ဢၼ်ၵိုၵ်းၸွမ်း တိတ်ႉသျူးဢွၵ်းဢေႃၼႆႉ မၼ်းႁႄႉႁၢမ်ႈတေႃႇ ၵၢၼ်လဵပ်ႈႁဵၼ်း လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢၼ်ပဵၼ်မႃး တီႈ ၸုမ်းယွႆႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၽွၼ်းယွၼ်ႈမၼ်းတႄႉ ဢမ်ႇပေႃးႁူႉလွင်ႈ ၽွၼ်းယွၼ်ႈ တွမ်ႇတွမ်ႊ လႄႈ ၵၢၼ်ထၢတ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢၼ်ပဵၼ်မႃး ယွၼ်ႉ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ၼင်ႇႁိုဝ် တေပွင်ႇၸႂ်လႆႈ ၽွၼ်းယွၼ်ႈ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢၼ်ပဵၼ်မႃး ယွၼ်ႉ ၵၢၼ်ႁဵတ်းၵၢၼ် ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ၶွင် ဢဵၼ်ႁႅင်း ၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈ ၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ Purkinje (PNs) ဢၼ်မီး ၸၼ်ႉထၢၼ်ႈ ဢၼ်ပႅၵ်ႇပိူင်ႈၵၼ် ဢၼ်ပဵၼ် လွင်ႈလူႉလႅဝ် ဢဵၼ်ႁႅင်း ဢၼ်ပဵၼ်မႃး ယွၼ်ႉ လွင်ႈယႃႉလူႉ ၽိဝ်ၼင် ၽၢႆႇၼွၵ်ႈ ဢဵၼ်ႁႅင်း ဢၼ်ႁူမ်ႈၵၼ်ဝႆႉ (Mfn2) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပိၵ်ႉသမ်ႉဝႃႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈသၼ်ႇထေႇ Mfn2 ၼ်ႂးၵူၼ်းၼႆႉ ၵွင်ႉၵႆႇၵၼ်တၢင်း ပိူင်ၽၢင်ၶွင် တၢင်းပဵၼ်ဢဵၼ်ဢၼ်ႁပ်ႉႁူႉလွင်ႈတူင်ႉၼိုင်ဢၼ်ၸပ်းၸိူဝ်ႉၸၢတ်ႈ ဢၼ်ႁွင်ႉဝႃႈ Charcot-Marie-Tooth မဵဝ်း 2A (15) ၼၼ်ႉသေတႃႉ၊ လွင်ႈယႃႉလူႉဢၼ်မီးငဝ်းလၢႆးၶွင် Mfn2 ၼ်ႂးၼူၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ပဵၼ်လွင်ႈဢၼ်လႆႈႁပ်ႉၶၢမ်ႇဝႆႉလီၶွင် လွင်ႈႁဵတ်းႁ်ႂႈပဵၼ်လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ်ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈၶွင် လွင်ႈထၢတ်ႈဢွၵ်ႇသီႇၵျိၼ်ႇ ၽွတ်ႉၾူဝ်ႇရီႇလႅၼ်ႇ (OXthoPHOS) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ မဵဝ်းသႅၼ်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ လၢႆလၢႆမဵဝ်း (16-19) လႄႈ ၽွၼ်းယွၼ်ႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်လူႉလႅဝ်ၵႂႃႇၼၼ်ႉ တေမႃးၸွမ်း ၾၢင်ႁၢင်ႊ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမႃး မိူၼ်ၼင်ႇ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ဢမ်ႇတႅတ်ႈၼႅတ်ႈ (18, 19) ဢမ်ႇၼၼ် လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ဢဵၼ်ႁႅင်း ဢမ်ႇတႅတ်ႈၼႅတ်ႈ (16) ၸိူဝ်းၼႆႉယဝ်ႉ။ ပေႃးၸႂ်ႉတိုဝ်း လွင်ႈႁူမ်ႈပွင်း ပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ဢမ်ႇမီး ၶေႃႈမၢႆ (LFQ) ၊ ပၢႆးထၢတ်ႈ ဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ တူဝ်ၶိင်း၊ လွင်ႈထႆႇႁၢင်ႊ လႄႈ လွၵ်းလၢႆး ပၢႆးမႅင်း ၸိူဝ်းၼႆႉသေ ႁဝ်းၶႃႈ ၼႄဝႃႈ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ ဢဵၼ်ႁႅင်း ဢၼ်လူႉလႅဝ်ၵႂႃႇ ၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ႁႅင်းထၢတ်ႈ pyruvate carboxylase (PCx) လႄႈ လွင်ႈတၢင်း တၢင်ႇဢၼ် ဢၼ်ၵဵဝ်ႇၵပ်း တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅၼ်ႇၶႅင် ၶွင် PNs ၼႂ်းတူဝ်မီးၸႂ် ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တႃႇတေထတ်းသၢင်တူၺ်း လွင်ႈၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်တင်း လွင်ႈၶူၼ်ႉႁၼ်ၼႆႉ ႁဝ်းၶႃႈလႆႈ ၵုမ်းထိင်း လွင်ႈၼေ PCx ၼႂ်း Mfn2-deficient PNs သေ လႆႈႁၼ်ဝႃႈ လွင်ႈႁဵတ်းသၢင်ႈဢၼ်ၼႆႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈတဵၵ်းတဵင် oxidative ႁၢဝ်ႈႁႅင်းမႃး လႄႈ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢဵၼ်ႁႅင်းယွမ်းလူင်း ဝႆးမႃးၼႆယဝ်ႉ။ လွင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ MFN2 ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼႆႉ ၸၢင်ႊၵႄႇသႄႇလႆႈ လွင်ႈလူႉလႅဝ် PN ဢၼ်မီး လွင်ႈႁၢမ်း OXPHOS ႁၢဝ်ႈႁႅင်း၊ လွင်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း mitochondrial DNA ၼမ်ၼမ် လႄႈ လွင်ႈၼႅၵ်ႉဝွၵ်ႉ mitochondrial ဢၼ်လူႉလႅဝ်ၵႂႃႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
တႃႇတေႁၼ်လႆႈ ဢဵၼ်ႁႅင်းၼႂ်း Mfn2 knockout PNs ၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၸိူဝ်ႉၼူ ဢၼ်ပၼ်ႁႂ်ႈ ဢဵၼ်ႁႅင်းဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် Cre ၼၼ်ႉ ယိူင်းၸူး ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်မီးသီလိူင် (YFP) (mtYFP) (20) Cre ဢၼ်ဢွၵ်ႇမႃးၼၼ်ႉသေ ထတ်းတူၺ်း ပိူင်ၽၢင်ဢဵၼ်ႁႅင်း ၼႂ်းတူဝ်မီးၸႂ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁဝ်းၶႃႈလႆႈႁၼ်ဝႃႈ လွင်ႈယႃႉလူႉ ၸိူဝ်ႉၽၼ်း Mfn2 ၼႂ်း PNs ၼႆႉ တေႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၼႅၵ်ႉဝွၵ်ႉ mitochondrial ၸႅၵ်ႇၽႄၵႂႃႇလွႆးလွႆး (ႁၢင်ႈ S1A) လႄႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်ၸဝ်ႉသုတ်းၼၼ်ႉ လႆႈႁၼ်မိူဝ်ႈ ဢသၢၵ်ႈ 3 ဝူင်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပေႃးမႃးၼိူင်းတူၺ်းၼႆ လွင်ႈယွမ်းလူင်း ဢၼ်ယႂ်ႇလူင် ၶွင်ထၢပ်ႈသႄး PN ၼၼ်ႉ မိူၼ်ၼင်ႇ လၵ်းထၢၼ်မၼ်း ဢၼ်လႆႈလူႉသုမ်း ႁႅင်းၶၢမ်ႇတူဝ် Calbindin ၼၼ်ႉ ဢမ်ႇတႄႇမႃး တေႃႇထိုင် ဢသၢၵ်ႈ 12 ဝူင်ႈ (ႁၢင်ႊ 1, A လႄႈ B) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶၢဝ်းယၢမ်းဢၼ်ဢမ်ႇမႅၼ်ႈၵၼ် ၼႂ်းၵႄႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ပိူင်ၾၢင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ လႄႈ လွင်ႈႁၼ်လႆႈ လွင်ႈတၢႆ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈထတ်းတူၺ်း လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢၼ်ပဵၼ်မႃး ယွၼ်ႉ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ် ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ မိူဝ်ႈပႆႇတၢႆၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ လွၵ်းလၢႆး ဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် လွင်ႈၸႅၵ်ႇၽႄ သႄးလ် ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း သၢႆလႅင်း (FACS) သေ ၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇ PN ဢၼ်ၼႄ YFP (YFP+) ၼၼ်ႉ ႁင်းၶေႃၶေႃ (ႁၢင်ႈ 1C) လႄႈ ၼႂ်းၼူ ဢၼ်ၵုမ်းထိင်းဝႆႉ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ၼၼ်ႉ ဝၢႆးၼႆႉ တေႁွင်ႉဝႃႈ CT1BRL (ႁၢင်ႈ 1C) ၼႆယဝ်ႉ။ လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွၵ်းလၢႆး ၵဵတ်ႉ ဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် လွင်ႈႁႅင်း ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ် တင်း သၢႆငၢႆ YFP ၼၼ်ႉ လီလိူဝ်မႃးၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ႁဝ်းၶႃႈ ၸၢင်ႊႁဵတ်းႁႂ်ႈ တူဝ်ၶိင်း YFP+ (YFPhigh) ၶွင် PNs ဢၼ်ဢမ်ႇၸႂ်ႈ PNs (YFPneg) (ႁၢင်ႈ S1B) ဢမ်ႇၼၼ် ဢၼ်ထၢင်ႇထိူမ်ဝႆႉ ဢၼ်ပဵၼ် ဢႅၵ်ႉသၼ်ႇ/တႅၼ်ႇၼီႇတိၵ်ႉ ဢၼ်မီးသၢႆလႅင်း (YFPlow; ႁၢင်ႈ S1D, connfirmed by microfigured, left) ၼၼ်ႉ မူတ်းသႂ်။ တႃႇတေမၵ်းမၼ်ႈလႆႈ လွင်ႈမၵ်းမၼ်ႈ ႁူဝ်ၼပ်ႉၵူၼ်း ဢၼ်ၸႅၵ်ႇၽႄဝႆႉၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈႁဵတ်း LFQ proteomics သေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ လႆႈထတ်းသၢင် ၶူဝ်းၶွင် ဢၼ်ပဵၼ်ပိူင်လူင်သေ လႆႈႁၼ်ဝႃႈ ၼႂ်းၵႄႈ သႄးလ် YFPhigh လႄႈ YFPneg ၼၼ်ႉ မီးလွင်ႈၽၢတ်ႇဢွၵ်ႇ ဢၼ်ၸႅင်ႈလႅင်းလီ (ႁၢင်ႈ S1C) ၼႆယဝ်ႉ။ သႄး YFPhigh ၼႆႉ ၼႄပၼ် လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ ၼႅတ်ႉ ၶွင် ၶေႃႈမၢႆ PNs ဢၼ်ႁူႉဝႆႉ (ပွင်ႇဝႃႈ Calb1, Pcp2, Grid2 လႄႈ Itpr3) (21, 22) ၵူၺ်းၵႃႈ ဢမ်ႇမီးလွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ ၶွင် ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ၵႆႉၼႄ ၼႂ်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢမ်ႇၼၼ် သႄးလ် မဵဝ်းတၢင်ႇဢၼ် (ႁၢင်ႈ 1D) )။ လွင်ႈတႅၵ်ႈၼိူင်း ၼႂ်းၵႄႈတူဝ်ယၢင်ႇ ၼႂ်းသႄးလ် YFPhigh ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဝႆႉ ဢၼ်ၵဵပ်းႁွမ်ဝႆႉ ၼႂ်းလွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်းလွတ်ႈလႅဝ်းၼၼ်ႉ ၼႄပၼ် လွင်ႈၵွင်ႉၵၢႆႇ ၵုၼ်း> 0.9 သေ ၼႄပၼ် လွင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇၶိုၼ်း ဢၼ်လီ ၼႂ်းၵႄႈ လွင်ႈမိူၼ်ၵၼ် ဢၼ်ၵဵဝ်ႇလူၺ်ႈ ပၢႆးၸႂ် (ႁၢင်ႈ S1E) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပေႃးတေလၢတ်ႈႁူဝ်ယွႆႈမၼ်းၸိုင် ၶေႃႈမုၼ်းၸိူဝ်းၼႆႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈၽႅၼ်ၵၢၼ်ႁဝ်း တႃႇလွင်ႈၸႅၵ်ႇၽႄ PN ဢၼ်ပဵၼ်လႆႈၼၼ်ႉ မီးလွင်ႈမၢၼ်ႇမႅၼ်ႈ။ ယွၼ်ႉပိူဝ်ႈဝႃႈ လွၵ်းလၢႆးႁေႃႈၵႃး L7-cre ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်းၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၼူၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ၶိုၼ်းႁူမ်ႈၵၼ် ၼႂ်းဝူင်ႈဢွၼ်တၢင်းသုတ်း ဝၢႆးသေ ၵိူတ်ႇလုၵ်ႈယဝ်ႉ (23) လႄႈ ႁဝ်းၶႃႈ ၸင်ႇတႄႇၶႃႈႁႅမ် ၼူ ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ CTRL လႄႈ ဢၼ်မီးငဝ်းလၢႆး (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) ၵဵပ်းႁွမ် ဢဵၼ်သၢႆၸႂ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးသေ ၶိုၼ်းႁူမ်ႈၵၼ်ယဝ်ႉတူဝ်ႈၵႂႃႇယဝ်ႉ မိူဝ်ႈဢႃႇယု 4 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ ႁွင်ႉဝႃႈ Mfn2cKO ၼႆယဝ်ႉ။ ၼင်ႇႁိုဝ် တေပဵၼ် တီႈသုတ်းမၼ်းၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ လိူၵ်ႈဢဝ် ဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈ မိူဝ်ႈၽွင်း PN layer ၼၼ်ႉ တိုၵ်ႉမီးဝႆႉ ပွတ်းတွၼ်ႈ ဢၼ်ႁၼ်ၸႅင်ႈလီယူႇသေတႃႉ (ႁၢင်ႈ 1B လႄႈ ႁၢင်ႈ S1A)။ ႁူမ်ႈၵၼ်တင်းမူတ်း ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း တင်းမူတ်း 3013 ဢၼ်သေ ၼႂ်းၼၼ်ႉ မွၵ်ႈ 22% ၼႆႉ ဢိင်ၼိူဝ် ၶေႃႈမၢႆတွင်း MitoCarta 2.0 ဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ပဵၼ် ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ၼႂ်းသဵၼ်ႈၼိူဝ်ႉ (ႁၢင်ႈ 1E) (ႁၢင်ႈ 1E) (24) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈၶၢဝ်ႇငၢဝ်း ၸိူဝ်ႉၽၼ်း ဢၼ်ပႅၵ်ႇပိူင်ႈၵၼ် ဢၼ်ႁဵတ်းဝႆႉ မိူဝ်ႈဝူင်ႈထူၼ်ႈ 8 ၼၼ်ႉ ၼႄဝႃႈ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း တင်းမူတ်း 10.5% ၵူၺ်း မီးလွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈ (ႁၢင်ႊ 1F လႄႈ ႁၢင်ႊ S1F)၊ ၼႂ်းၼၼ်ႉ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း 195 ၼႆႉ လႆႈထုၵ်ႇ ၵုမ်းထိင်းလူင်း လႄႈ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း 120 ၼႆႉ လႆႈထုၵ်ႇ ၵုမ်းထိင်း ၶိုၼ်ႈ (ႁၢင်ႊ 1F) ၼႆယဝ်ႉ။ ဢၼ်လီမၢႆတွင်းတႄႉ “လွင်ႈထတ်းသၢင် သဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်ၶူင်ႊသၢင်ႈဢွၵ်ႇမႃး” ၶွင် ၶေႃႈမုၼ်းဢၼ်ၼႆႉ ၼႄဝႃႈ ၸိူဝ်ႉၽၼ်း ဢၼ်ၼႄဝႆႉ လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈၵၼ်ၼၼ်ႉ ပိူင်လူင်မၼ်း ပဵၼ်ၶွင် သဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်ႁႄႉႁၢမ်ႈဝႆႉ ၶွင် သဵၼ်ႈတၢင်း ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢၼ်တႅတ်ႈၼႅတ်ႈၼၼ်ႉ (ႁၢင်ႈ 1G)။ ဢၼ်လီၶဝ်ႈၸႂ်တႄႉ ပႅၵ်ႉသမ်ႉဝႃႈ လွင်ႈလူတ်းယွမ်းတေႃႇ သဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇတင်း OXPHOS လႄႈ ထၢတ်ႈ calcium ၼႆႉ မၼ်းမၵ်းမၼ်ႈတေႃႇ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ် ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ တီႈ mitochondrial တီႈ PNs ဢၼ်ႁၢမ်း လွင်ႈႁူမ်ႈႁွမ်းၵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တွၼ်ႊတၢင်ႇၸိူဝ်း ဢၼ်ပႃး amino acid metabolism ၼႆႉ မၼ်းလႆႈ ၵုမ်းထိင်းတေႃႇ လွင်ႈထၢတ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢၼ်မီးတီႈ mitochdrion P ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶိုၼ်းသၢႆၾႆး ပဵၼ်ဢၼ်မၼ်ႈၵိုမ်း။ ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈ။
(A) ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်တၢင်တူဝ် ပွတ်းတွၼ်ႈ ဢွၵ်းဢေႃ ၼူ CTRL လႄႈ Mfn2cKO ဢၼ်ၼႄပၼ် လွင်ႈလူႉသုမ်း PNs ဢၼ်ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမႃး (calbindin, gray)၊ nuclei ၸိူဝ်းၼႆႉ လႆႈဢဝ် DAPI မႃးၶိုၼ်း။ (B) လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ (A) (လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ ဢၼ်ပဵၼ်တၢင်းလဵဝ်၊ ***P<0.001; n = 4 တေႃႇထိုင် 6 ဝူင်း ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၼူသၢမ်တူဝ်)။ (ၵ) လၢႆးႁဵတ်းၵၢၼ် ဢၼ်ၸၢမ်းတူၺ်း။ (D) လွင်ႈၽႄႈၸွတ်ႇ ၽႅၼ်ႇလိၼ်မႆႈ ၶွင် ၶေႃႈမၢႆ ဢၼ်တႅတ်ႈၼႅတ်ႈ တႃႇ Purkinje (ၼိူဝ်) လႄႈ မဵဝ်းသႅၼ်း သႄးလ် တၢင်ႇၸိူဝ်း (ၵၢင်)။ (E) ႁၢင်ႈၽၢင် Venn ဢၼ်ၼႄပၼ် တၢင်းၼမ် ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်လႆႈႁူႉႁၼ် ၼႂ်း PN ဢၼ်ၸႅၵ်ႇၽႄဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ (F) ၽႅၼ်ႇလိၼ်လွႆၾႆး ဢၼ်ၼႄဝႆႉ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ပႅၵ်ႇပိူင်ႈၵၼ် တီႈၼႂ်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ Mfn2cKO မိူဝ်ႈ 8 ဝူင်ႈ (ၵႃႊၶၼ် ဢၼ်တတ်းဝႆႉ တီႈပွင်ႇ 1.3)။ (G) လွင်ႈထတ်းသၢင် သဵၼ်ႈတၢင်းၶူင်သၢင်ႈၼႆႉ ၼႄပၼ် သဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈလိူဝ်ပိူၼ်ႈ ႁႃႈဢၼ် ဢၼ်ပဵၼ် သဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်ၶိုၼ်ႈ (သီလႅင်) လႄႈ ဢၼ်လူင်း (သီၶဵဝ်) ၼႂ်း Mfn2cKO PN ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဝႆႉ ပဵၼ် 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼႄဝႆႉ ၸၼ်ႉၽတ်ႉၽဵင်ႇ လွင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်သွၵ်ႈႁၼ်ဝႆႉ ၵူႊဢၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၽႅၼ်ႇလိၼ်မႆႈ ဢၼ်ပဵၼ်သီၶဵဝ် - ၵႃႈၶၼ် P ဢၼ်မႄးဝႆႉ။ ns ဢမ်ႇလမ်ႇလွင်ႈ။
ၶေႃႈမုၼ်း ပၢႆးထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ၼေဝႆႉဝႃႈ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ဢွၵ်ႇမႃး တီႈ ၶူၼ်းလေႃး I, III, လႄႈ IV ၼၼ်ႉ ယွမ်းလူင်းၵႂႃႇလွႆးလွႆးၼႆယဝ်ႉ။ ၶွမ်ႇပလႅၵ်ႉ I, III, လႄႈ IV တင်းမူတ်းၼႆႉ ပႃးဝႆႉ ၶူဝ်းၶွင်ယွႆႈယႅမ်း ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ ဢၼ်မီး mtDNA သေ ၶွမ်ႇပလႅၵ်ႉ II ဢၼ်ပဵၼ် ၶူတ်ႉၼျူႇၶလီးယႃးၵွၺ်းၼၼ်ႉ ဢမ်ႇလႆႈထုၵ်ႇ တုမ်ႉတိူဝ်ႉသင် (ႁၢင်ႈ 2A လႄႈ ႁၢင်ႈ S2A)။ ။ ၸွမ်းၼင်ႇ ၶေႃႈတွပ်ႇ ပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉသေ ပၢႆးထၢတ်ႈ ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ တၢင်းပဵၼ် ၶွင် တိတ်ႉသျူး ဢွၵ်းဢေႃ ၼၼ်ႉ ၼႄဝႃႈ ၸၼ်ႉ MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) ၶွင် ၶူၼ်းလေႃး IV ၼႂ်း PN ၼၼ်ႉ ယွမ်းလူင်းၵႂႃႇလွႆးလွႆး (ႁၢင်ႈ 2B) ၼႆယဝ်ႉ။ mtDNA-encoded subunit Mtatp8 ၼႆႉ လႆႈလူတ်းယွမ်းလူင်းၵႂႃႇ တေႉတေႉဝႃႈဝႃႈ (ႁၢင်ႊ S2A) ၽွင်းမိူဝ်ႈ ၸၼ်ႉၼိမ်သဝ်း ၶွင် ၼယူးၵရီးယႃး ဢၼ်ပဵၼ် မၢႆလပ်ႉ ATP synthase ၼၼ်ႉ ဢမ်ႇလႅၵ်ႈလၢႆႊသင်သေ မၼ်းၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်တင်း လွင်ႈၼိမ်သဝ်း ဢၼ်ႁူႉဝႆႉဝႃႈ ပဵၼ် ATP synthase subunit F1 ဢၼ်ၼိမ်သဝ်း မိူဝ်ႈ mtDNA ၼေႁၢင်ႊၼၼ်ႉ ၼိမ်သဝ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၶွတ်ႇၽွတ်ႈမၼ်း မၼ်းၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်။ ၶၢတ်ႇ (7)။ လွင်ႈထတ်းသၢင် ၸၼ်ႉ mtDNA ၼႂ်း Mfn2cKO PNs ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဝႆႉ လူၺ်ႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ ၶိူဝ်းၶိူဝ်းယႂ်းယႂ်း ဢၼ်ပဵၼ်ၶၢဝ်းယၢမ်းတႄႉတႄႉ (qPCR) ၼၼ်ႉ မၵ်းမၼ်ႈဝႃႈ တၢင်းၼမ် ဢၼ်မိူၼ် mtDNA ၼၼ်ႉ ယွမ်းလူင်းၵႂႃႇလွႆးလွႆးၼႆယဝ်ႉ။ ပေႃးမႃးၼိူင်းၵၼ်တင်း ၸုမ်းၵုမ်းထိင်းၼၼ်ႉၸိုင် မိူဝ်ႈဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ mtDNA ဢၼ်ၵိုတ်းဝႆႉၼၼ်ႉ မီးမွၵ်ႈ 20% ၵူၺ်း (ႁၢင်ႈ 2C)။ ဢၼ်ၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်တင်း ၶေႃႈတွပ်ႇၸိူဝ်းၼႆႉသေ လွင်ႈဢဝ်မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်မီးတီႈလဵဝ်ၵၼ်ၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ်သီ Mfn2cKO PNs တႃႇသွၵ်ႈႁႃ DNA ၼၼ်ႉ ၼႄပၼ် လွင်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ်ၶၢဝ်းယၢမ်း ၶွင် mitochondrial nucleotides (ႁၢင်ႈ 2D) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁဝ်းၶႃႈလႆႈႁၼ်ဝႃႈ ၽူႈတႅၼ်းၽွင်းၵမ်ႈၽွင်ႈ ဢၼ်ၶဝ်ႈပႃးၼႂ်း လွင်ႈယႃႉလူႉ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း mitochondrial လႄႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ လွင်ႈၶီၸႂ်ၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇၵုမ်းထိင်းဝႆႉ ဢိၵ်ႇပႃး Lonp1, Afg3l2 လႄႈ Clpx လႄႈ လွင်ႈတၢင်း ဢၼ်သုၵ်ႉသၢၵ်ႉ OXPHOS ၸိူဝ်းၼႆႉၵွၺ်း။ ဢမ်ႇႁၼ် လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈ ၼႂ်းၸၼ်ႉ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ၶဝ်ႈပႃး ၼႂ်း apoptosis ၼၼ်ႉ (ႁၢင်ႈ S2B)။ မိူၼ်ၼၼ်ၼင်ႇၵဝ်ႇ ႁဝ်းၶႃႈလႆႈႁၼ်ဝႃႈ ဢွၵ်းဢေႃ လႄႈ ဢႅၼ်ႇတူဝ်ႇပလႅတ်ႉသမ်ႇ ဢၼ်ၶဝ်ႈပႃးၼႂ်း ၵၢၼ်တေႃႉသူင်ႇ ၶႄႇလ်သီႇယမ်ႇၼၼ်ႉ မီးလွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢိတ်းဢွတ်းၵူၺ်း (ႁၢင်ႈ S2C)။ လိူဝ်သေၼၼ်ႉဢမ်ႇၵႃး၊ လွင်ႈထတ်းသၢင်ၶွင် ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်းဢၼ်ၵဵဝ်ႇလူၺ်ႈလွင်ႈၵိၼ်တူဝ်ၵဝ်ႇၼၼ်ႉ ဢမ်ႇႁၼ်လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈ၊ ဢၼ်ၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်တၢင်း လွင်ႈဢၼ်ႁၼ်လႆႈလွင်ႈၸုင်ၸၼ်ၶွင် autophagosomes ဢၼ်လႆႈသွၵ်ႈႁၼ်ဝႆႉၼ်ႂးတူဝ်မီးၸ်ႂလူၺ်ႈ ပၢႆးထၢတ်ႈဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈတၢင်းပဵၼ် လႄႈ မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉၼွႆႉ ဢီႇလႅတ်ႇထရုၼ်ႇ(ႁၢင်ႊ S3) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵူၺ်းၵႃႊ လွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈ OXPHOS ဢၼ်ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမႃး တီႈ PNs ၼႆႉ မၼ်းမႃးၸွမ်း လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢၼ်ႁၼ်ၸႅင်ႈလီ တီႈ mitochondrial ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸုမ်း Mitochondrial ၼႆႉ တေလႆႈႁၼ် တီႈတူဝ်ၶိင်း သႄးလ် လႄႈ တူၼ်ႈမႆႉ dendritic ၶွင် Mfn2cKO PNs ဢၼ်ဢႃႇယု 5 လႄႈ 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉသေ လွင်ႈၵေႃႇသၢင်ႈ ၽိဝ်ၼင် ၽၢႆႇၼႂ်းၼၼ်ႉ လႆႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ႁၢဝ်ႈႁႅင်းမႃး (ႁၢင်ႈ S4, A လႄႈ B)။ ဢၼ်ၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်တင်း လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်ၵေႃႇသၢင်ႈဝႆႉ ၽၢႆႇၼိူဝ်ၸိူဝ်းၼႆႉလႄႈ လွင်ႈယွမ်းလူင်း mtDNA ဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈၼၼ်ႉသေ လွင်ႈထတ်းသၢင် ၶွင် ဢွၵ်းဢေႃဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်း ဢၼ်ပႃး tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) ၼၼ်ႉ ၼႄဝႃႈ ၼမ်ႉၵတ်ႉ ၽိဝ်ၼင် ဢၼ်မီးၼႂ်း Mfn2cKO PNs ၼၼ်ႉ ယွမ်းလူင်းၵႂႃႇ တင်းၼမ် (ႁၢင်ႈ S4C) ၼႆယဝ်ႉ။
(ၵ) လွင်ႈထတ်းသၢင်ၶၢဝ်းယၢမ်း ၸၼ်ႉထၢၼ်ႈလွင်ႈၼႄ ၶွင် OXPHOS complex ။ ဝူၼ်ႉသွၼ်ႇ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်မီး P<0.05 မိူဝ်ႈ 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉၵွၺ်း (ANOVA သွင်ၽၢႆႇ)။ ထႅဝ်ဢၼ်ပဵၼ်တုမ်ႇ - ဢမ်ႇမီးလွင်ႈမူၼ်ႉမႄးသင် ပေႃးမႃးၼိူင်းၵၼ်တင်း CTRL ။ (B) ၽၢႆႇသၢႆႉ - တူဝ်ယၢင်ႇ တွၼ်ႈဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီး ၶေႃႈမၢႆဝႆႉ တင်း ၶူဝ်းၶွင် ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ MTCO1 (scale bar, 20 μm) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈဢၼ် တူဝ်ၶိင်း သႄးလ် Purkinje ၶဝ် ၵုမ်းၵမ်ဝႆႉၼၼ်ႉ ပဵၼ်သီလိူင်။ ၽၢႆႇၶႂႃ - လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ ၸၼ်ႉ MTCO1 (လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ တၢင်းလဵဝ်၊ n = 7 တေႃႇထိုင် 20 သႄးလ် ဢၼ်ထတ်းသၢင် တီႈၼူသၢမ်တူဝ်)။ (C) လွင်ႈထတ်းသၢင် qPCR ၶွင် မၢႆမိူၼ် mtDNA ၼႂ်း PN ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဝႆႉ (လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ ဢၼ်မီးတၢင်းလဵဝ်၊ n = 3 တေႃႇထိုင် 7 ၼူ)။ (D) ၽၢႆႇသၢႆႉ - တူဝ်ယၢင်ႇ ၶႅပ်းဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီး ၶူဝ်ႈၶွင် ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ DNA (scale bar, 20 μm) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈဢၼ် တူဝ်ၶိင်း သႄးလ် Purkinje ၶဝ် ၵုမ်းၵမ်ဝႆႉၼၼ်ႉ ပဵၼ်သီလိူင်။ ၽၢႆႇၶႂႃ - လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ လွင်ႈပဵၼ်ႁွႆးၸဵပ်း mtDNA (လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ ဢၼ်မီးတၢင်းလဵဝ်၊ n = 5 တေႃႇထိုင် 9 သႄးလ် ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၼူသၢမ်တူဝ်)။ (E) တူဝ်ယၢင်ႇ တွၼ်ႈဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်း ဢၼ်ၼႄဝႆႉ သႄးလ် mitoYFP + Purkinje (ၵၢင်ႇပိုၼ်) ၼႂ်းလွင်ႈမၢႆတွင်း ၶိူင်ႈၶွတ်ႇၽွတ်ႈ သႄးလ်တင်းမူတ်း။ (F) လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ IV ၶွပ်ႇ။ (G) လွင်ႈမၢႆတွင်း ဢၼ်တၢင်တူဝ် လွင်ႈသႂ်ႇ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ဢမ်ႇမီး ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ၼႂ်းသႄးလ် CTRL လႄႈ Mfn2cKO Purkinje ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ Top trace - ပဵၼ်သၢႆၸႂ်ဢွၼ်တၢင်းသုတ်း ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ AP ပဵၼ်မႃး။ ၸွမ်းတႂ်ႈ - AP ဢၼ်သုင်သုတ်း။ (H) လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ ၶေႃႈၶဝ်ႈမႃး ဢၼ်ပဵၼ်မႃးႁင်းၵူၺ်း ဝၢႆးသေ ဢွၵ်းဢေႃ (sPSPs) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈမၢႆတွင်း ဢၼ်တၢင်တူဝ် လႄႈ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမၼ်းၼၼ်ႉ ၼႄဝႆႉ တီႈ (I) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ ဢၼ်မီးတၢင်းလဵဝ်ၼၼ်ႉ ထတ်းသၢင်တူၺ်း n = 5 တေႃႇထိုင် 20 သႄးလ် ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၼူသၢမ်တူဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်ၼႄဝႆႉ ပဵၼ် mean±SEM ၊ *ၽ<0.05၊ **ၽ<0.01၊ ***ၽ<0.001။ (J) ႁွႆးတၢင်တူဝ် AP ဢၼ်ပဵၼ်မႃးႁင်းၵူၺ်း ဢၼ်မၢႆတွင်းဝႆႉ လူၺ်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း လၢႆးၶွတ်ႇၽွတ်ႈ ၽႅၼ်ႇဢၼ်မီးႁူး။ Top trace : AP ဢၼ်သုင်သုတ်း။ ၸွမ်းတႂ်ႈ - ၸူမ်း AP ဢၼ်လဵဝ်။ (K) ၼပ်ႉသွၼ်ႇ AP ၽတ်ႉၽဵင်ႇလႄႈ သုင်သုတ်း ၸွမ်းၼင်ႇ (J) ၼၼ်ႉ။ လွင်ႈထတ်းသၢင် မႅၼ်ႇဝီႇတီႇ၊ n = 5 သႄးလ် ဢၼ်လႆႈထတ်းသၢင်တူၺ်း တီႈၼူ 4 တူဝ်။ ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်ၼႄဝႆႉ ပဵၼ် mean±SEM ၊ ဢမ်ႇလမ်ႇလွင်ႈ။
လွင်ႈလူႉသုမ်း OXPHOS ဢၼ်ႁၼ်ၸႅင်ႈလီၼၼ်ႉ လႆႈႁၼ်တီႈ Mfn2cKO PN ဢၼ်မီးဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉသေ ၼႄဝႃႈ လွင်ႈႁဵတ်းသၢင်ႈ ၽၢႆႇပၢႆးတူဝ် ၶွင် ဢဵၼ်သၢႆၸႂ်ၼၼ်ႉ ဢမ်ႇၽဵၼ်ႈၽဵၼ်ႈႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼႆယဝ်ႉ။ ယွၼ်ႉၼၼ် ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈထတ်းသၢင်တူၺ်း ၽၢင်ႁၢင်ႈ ၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ် ၶွင် ဢဵၼ်သၢႆၸႂ် ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS မိူဝ်ႈ 4 တေႃႇ 5 ဝူင်ႈ လႄႈ 7 တေႃႇ 8 ဝူင်ႈ လူၺ်ႈ ႁဵတ်းၵၢၼ် မၢႆတွင်း ပႅတ်ႉၶလႅမ်ႇ သႄးလ် တင်းမူတ်း ၼႂ်း ၽိုၼ်လိၵ်ႈ ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်း (ႁၢင်ႈ 2E) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢမ်ႇထၢင်ႇဝႃႈ ၽတ်ႉၽဵင်ႇ ၽိဝ်ၼင် ဢၼ်လိုဝ်ႈသဝ်း လႄႈ လွင်ႈၶၢမ်ႇလႆႈ ဢၼ်ၶဝ်ႈမႃး ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ Mfn2cKO ၼၼ်ႉ မိူၼ်ၵၼ်တင်း လွင်ႈၵုမ်းထိင်းၼၼ်ႉသေတႃႉ မီးလွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ ဢၼ်ဢမ်ႇပေႃးႁၼ်လႆႈ ၼႂ်းၵႄႈ သႄးလ် (လွၵ်း 1) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ မိူၼ်ၼၼ်ၼင်ႇၵဝ်ႇ မိူဝ်ႈဢႃႇယု 4 ထိုင် 5 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ ဢမ်ႇႁၼ်လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈ ၼႂ်းလွင်ႈၵွင်ႉၵၢႆႇ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ လႄႈ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ (IV curve) (ႁၢင်ႈ 2F)။ ၵူၺ်းၵႃႈ ဢမ်ႇမီး ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ Mfn2cKO ဢၼ်ဢႃႇယု 7 တေႃႇထိုင် 8 ဝူင်ႈ ဢၼ်လွတ်ႈၽေး IV regimen (ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ hyperpolarization) ၼၼ်ႉသေ ၼႄဝႃႈ မၼ်းမီးလွင်ႈႁူႉႁၼ် ဢၼ်ၸႅင်ႈလႅင်း ၼိူဝ် လွင်ႈၸၢင်ႈပဵၼ် hyperpolarization တီႈၸၼ်ႉဝၢႆးလင်ၼႆႉယူႇ။ ပေႃးမႃးၼိူင်းတူၺ်းၼႆ တီႈၼႂ်း Mfn2cKO neurons ၼႆႉ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ဢၼ်ၶိုၼ်းပဵၼ်ၶိုၼ်း (AP) ၼၼ်ႉ မၼ်းၶၢမ်ႇလႆႈလီသေ ၼႄဝႃႈ ပိူင်ဢွၵ်ႇၶဝ် တင်းမူတ်းၼႆႉ ဢမ်ႇပိူင်ႈသင်ၵၼ်တင်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ၵုမ်းထိင်း ဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ (လွၵ်း 1 လႄႈ ႁၢင်ႈ 2G)။ မိူၼ်ၼင်ႇၼၼ် လွင်ႈၵမ်းၵမ်းပဵၼ် လႄႈ သၢႆႁိူဝ်ႈလႅင်း ဢၼ်ပဵၼ်မႃးႁင်းၵူၺ်း ဢၼ်ပဵၼ် ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ပဵၼ်မႃး ႁင်းၶေႃၶေႃ (sPSCs) ၼၼ်ႉ လႆႈတႅၵ်ႈၼိူင်းၵၼ်တင်း ၸုမ်းၵုမ်းထိင်းၼၼ်ႉသေ လွင်ႈၵမ်းၵမ်းပဵၼ် ဢၼ်ပဵၼ်မႃးၼၼ်ႉ လုၵ်ႉတီႈ 4 ဝူင်ႈ တေႃႇထိုင် 5 ဝူင်ႈ တေႃႇထိုင် 7 ဝူင်ႈ တေႃႇထိုင် 8 ဝူင်ႈ ဢၼ်ၶိုၼ်ႈမႃး မိူၼ်ၵၼ်ၼၼ်ႉ (ႁၢင်ႈ 2, H လႄႈ I)။ ၶၢဝ်းယၢမ်း ဢၼ် ဢဵၼ်သၢႆၸႂ် ၵႅၼ်ႇၶႅင် ၼႂ်း PNs (25) ။ ဝၢႆးသေ ဢဝ် PNs ဢၼ်ႁူးဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ လႆႈၶေႃႈတွပ်ႇမိူၼ်ၵၼ်။ လွင်ႈၶွတ်ႇၽွတ်ႈဢၼ်ၼႆႉ ႁႄႉၵင်ႈပၼ် လွင်ႈဢၼ်ၸၢင်ႈပဵၼ်လႆႈ လွင်ႈသၢႆႈတႅၼ်း လွင်ႈဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ATP ၶွင်သႄးလ် မိူၼ်ၼင်ႇ ဢၼ်ၸၢင်ႈပဵၼ်မႃး ၼႂ်းလွင်ႈမၢႆတွင်း ၶွပ်ႇလႅၼ်းယႃႈ ၶွင်သႄးလ်တင်းမူတ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈတေႉမၼ်း ၼမ်ႉၵတ်ႉၽိဝ်ၼင် ဢၼ်လိုဝ်ႈသဝ်း လႄႈ လွင်ႈၵမ်းၵမ်း ယိုဝ်းႁင်းၵူၺ်း ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ Mfn2cKO ၼၼ်ႉ ဢမ်ႇလႆႈထုၵ်ႇ တုမ်ႉတိူဝ်ႉ (ႁၢင်ႈ 2, J လႄႈ K)။ ပေႃးတေလၢတ်ႈႁူဝ်ယွႆႈမၼ်းၸိုင် ၶေႃႈတွပ်ႇၸိူဝ်းၼႆႉ ၼႄဝႃႈ PNs ဢၼ်မီးလွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ် OXPHOS ဢၼ်ႁၼ်ၸႅင်ႈလီၼၼ်ႉ ၸၢင်ႈၶၢမ်ႇလႆႈ ပိူင်ၾၢင် လွင်ႈဢွၵ်ႇသဵင် ဢၼ်မီးသၢႆငၢႆသုင်ၼၼ်ႉလီလီသေ ၼႄဝႃႈ မီးလွၵ်းလၢႆးသၢႆႈတႅၼ်း ဢၼ်ပၼ်ႁႂ်ႈၶဝ် ထိင်းသိမ်းလႆႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ ဢၼ်ၸမ်တေပဵၼ် ၽဵၼ်ႈၽဵၼ်ႈၼၼ်ႉယူႇ။
ၶေႃႈမုၼ်းၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈၼႄဝႆႉ မိူၼ်ၼင်ႇ ၽတ်ႉၽဵင်ႇ ± SEM (လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ ဢၼ်မီးတၢင်းလဵဝ်၊ လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈတႅၵ်ႈၼိူင်း လၢႆလၢႆဢၼ် ၶွင် Holm-Sidak၊ *P<0.05)။ မၢႆယူၼ်း ဢၼ်ဢဝ် ၶွပ်ႇ ၼႄဝႆႉ။
ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈတမ်းဝၢင်း တႃႇတေထတ်းသၢင်တူၺ်းဝႃႈ ၼႂ်းၶေႃႈမုၼ်း ပရူဝ်ႇတိၼ်း (ႁၢင်ႈ 1G) ၼၼ်ႉ ၸွင်ႇမၼ်းပႃး သဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်ၸၢင်ႊ ၶႄႉၶဵင်ႇ လွင်ႈႁၢမ်း OXPHOS ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉႁိုဝ်ၼႆသေ ၸင်ႇလႆႈ သပ်းလႅင်းၼႄဝႃႈ ယွၼ်ႉသင် PN ဢၼ်လႆႈထုၵ်ႇ တုမ်ႉတိူဝ်ႉၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊထိင်းသိမ်းလႆႈ ပၢႆးၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ၸမ်တေပဵၼ် ၽဵၼ်ႈၽဵၼ်ႈၼၼ်ႉယူႇႁိုဝ် (ႁၢင်ႈ 2, E တေႃႇထိုင် K) ၼႆယဝ်ႉ။ ။ ၵၢၼ်ထတ်းၸႅတ်ႈ ပရူဝ်ႇတိၼ်းၼိတ်ႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ ဢႅၼ်ႇၸႆး(မ်) ဢၼ်ပႃးၼႂ်း ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢႃႇမၢႆၼူဝ်ႇဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ၵိင်ႇၽေ (BCAA) ၼႆႉ လႆႈထုၵ်ႇ ၵုမ်းထိင်းဝႆႉ တေႉတေႉဝႃႈဝႃႈ (ႁၢင်ႊ 3A လႄႈ ႁၢင်ႊ S5A) လႄႈ ၶူဝ်းၵုၼ်ႇ ဢၼ်ဢွၵ်ႇမႃး ၵမ်းလိုၼ်းသုတ်း ဢၼ်ပဵၼ် acetyl-CoA (CoA) ဢမ်ႇၼၼ် succinyl CoA ၼႆႉ ၸၢင်ႊၽိူမ်ႉထႅမ်ပၼ် ထၢတ်ႈ tricarboxylates တီႈၼႂ်း တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅပ်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁဝ်းၶႃႈလႆႈႁၼ်ဝႃႈ ထၢတ်ႈ BCAA ဢၼ်ပဵၼ် ထၢတ်ႈ BCAT1 (BCAT1) လႄႈ BCAT2 တင်းသွင်ဢၼ်ၼႆႉ ၼမ်မႃးၼႆယဝ်ႉ။ ၶဝ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၶၵ်ႉတွၼ်ႈဢွၼ်တၢင်းသုတ်း ၶွင် BCAA ၶူၼ်းလေႃးၵၼ် လူၺ်ႈ ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ၵလူဝ်ႇတႅတ်ႉ ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ α-ketoglutarate (26) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တွၼ်ႊယွႆႈယႅမ်း ဢၼ်ႁဵတ်းပဵၼ် ၵိင်ႇၽေ keto acid dehydrogenase (BCKD) ၼႆႉ လႆႈထုၵ်ႇ ၵုမ်းထိင်းဝႆႉ (လွင်ႈသုၵ်ႉသၢၵ်ႉၼႆႉ ပဵၼ်ၶိူင်ႈၸွႆႈထၢတ်ႈ ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ထၢတ်ႈၵႃႇပုၼ်ႇ BCAA ဢၼ်ပဵၼ်မႃး ဝၢႆးလိုၼ်းၼၼ်ႉ ဢမ်ႇၸၢင်ႊၶိုၼ်းပဵၼ်လႆႈ) (ႁၢင်ႊ 3A လႄႈ ႁၢင်ႊ S5A)။ ၵူၺ်းၵႃႊ ဢမ်ႇႁၼ် လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢၼ်ႁၼ်ၸႅင်ႈလႅင်း တီႈ BCAA ႁင်းမၼ်း တီႈၼႂ်း PN ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဝႆႉၼၼ်ႉသေ ၸၢင်ႊပဵၼ်ယွၼ်ႉ ဢႃႇမၢႆၼူဝ်ႇဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈၸိူဝ်းၼႆႉ ၼႂ်းသႄးလ်ၶဝ် ၼမ်မႃး ဢမ်ႇၼၼ် ၸႂ်ႉတိုဝ်း ငဝ်ႈတိုၼ်းတၢင်ႇဢၼ် (ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇ ဢမ်ႇၼၼ် လႅၵ်ႉတိၵ်ႉဢႅတ်ႉသိတ်ႉ) တႃႇၽိူမ်ႉထႅမ်ပၼ် ပၼ်ႇၶွပ်ႈ TCA (ႁၢင်ႊ S5B) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ PNs ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼၼ်ႉၵေႃႈ ၼႄပၼ် လွင်ႈယႃႉၵဝ်း ၵလူဝ်ႇတမ်ႇမိၼ်ႇ လႄႈ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ၼမ်ႉၼၵ်း မိူဝ်ႈဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉသေ ဢၼ်ၼႆႉ ၸၢင်ႊၼႄလႆႈ လူၺ်ႈ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ ၶွင် ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် ၵလူဝ်ႇတမ်ႇမိၼ်ႇ (GLS) လႄႈ ၵလူဝ်ႇတမ်ႇမိၼ်ႇ ပၢႆႇရူဝ်ႇဝႅတ်ႉ လႅၵ်ႈလၢႆႊ 2 (GPT2) (ႁၢင်ႊ 3, A လႄႈ C) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢၼ်လီမၢႆတွင်းတႄႉ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇၶွင် GLS ၼႆႉ မၼ်းမၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ တီႈ isoform glutaminase C (GLS-GAC) ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဝႆႉ (လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈၶွင် Mfn2cKO/CTRL ၼႆႉ မီးမွၵ်ႈ 4.5 ပုၼ်ႈ၊ P = 0.05) လႄႈ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇၶွင်မၼ်း ဢၼ်တႅတ်ႈၼႅတ်ႈ တီႈၼႂ်း တိတ်ႉသျူး ၶႅၼ်ႇသိူဝ်ႇၼၼ်ႉ ၸၢင်ႈၵမ်ႉထႅမ်ပၼ် ဢဵၼ်ႁႅင်းတူဝ်ၸႂ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ (27)။
(A) ၽႅၼ်ႇလိၼ်မႆႈ ၼႄပၼ် လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ၽွတ်ႈႁႅၼ်း ၼႂ်းထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း တႃႇသဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ မိူဝ်ႈ 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ (B) တူဝ်ယၢင်ႇ ၶႅပ်းဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီး ၶေႃႈမၢႆဝႆႉ တင်း ၶိူင်ႈႁႄႉၵင်ႈ PCx (scale bar, 20 μm) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵၢင်ႇသီလိူင်ၼၼ်ႉ ၸီႉၼႄ တူဝ်ၶိင်း သႄးလ် Purkinje ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ (C) လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢွၵ်ႇမႃး ၸွမ်းၶၢဝ်းယၢမ်း ဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈဝႃႈ ပဵၼ် ၽူႈတႅၼ်းၽွင်း ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ တႃႇ တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅပ်ႈ (t-test လၢႆလၢႆဢၼ်၊ *FDR <5%; n = 3-5 ၼူ)။ (D) ၽၢႆႇၼိူဝ် - ႁၢင်ႈၽၢင် ဢၼ်ၼႄဝႆႉ လၢႆးတၢင်း ဢၼ်ပႅၵ်ႇပိူင်ႈၵၼ် တႃႇၶဝ်ႈၼႂ်း ၵႃႇပုၼ်ႇ ဢၼ်မီး မၢႆတွင်းဝႆႉ ဢၼ်ပႃးၼႂ်း [1-13C]pyruvate tracer (ပွင်ႇဝႃႈ လူၺ်ႈ PDH ဢမ်ႇၼၼ် သဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်လတ်းၽၢၼ်ႇ သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တႂ်ႈ - ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဝီႇဢူဝ်ႇလီႇ ၼႄဝႆႉ ႁူဝ်ပၢၵ်ႇ ၵႃႇပုၼ်ႇ ဢၼ်မီး မၢႆတွင်း ဢၼ်လဵဝ် (M1) ဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႈပဵၼ် ဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ဢႅတ်ႉသိတ်ႉ၊ (င) လွင်ႈထတ်းသၢင်ပိုၼ်းၶၢဝ်းယၢမ်း ဢၼ်ၵုမ်ႇထူၼ်ႈ ၶွင်သဵၼ်ႈတၢင်းဢၼ်ၼႄဝႆႉၼၼ်ႉ။ ဝူၼ်ႉသွၼ်ႇ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်မီး P<0.05 မိူဝ်ႈ 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉၵွၺ်း။ ထႅဝ်ၶိတ်ႇ - ဢမ်ႇမီးၵႃႈၶၼ် ဢၼ်မႄးလႆႈ (လွင်ႈထတ်းသၢင် သွင်ၽၢႆႇ လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ၊ * P <0.05၊ *** P <0.001)။ ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်ၼႄဝႆႉ ပဵၼ် mean±SEM ။
ၼႂ်းၵၢၼ်ထတ်းၸႅတ်ႈႁဝ်းၼႆႉ BCAA catabolism ၼႆႉ လႆႈပဵၼ်မႃး သဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ ဢၼ်ၼိူင်ႈယဝ်ႉ။ လွင်ႈၼႆႉ မၼ်းၼႄပၼ် ႁၢဝ်ႈႁႅင်းဝႃႈ တၢင်းၼမ်လူမ်းၶဝ်ႈမႃး ၼႂ်းပၼ်ႇႁွပ်ႈ TCA ၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊလႅၵ်ႈလၢႆႈၵႂႃႇ တီႈ PN ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢၼ်ၼႆႉ မၼ်းတေတၢင်တူဝ် ပိူင်လူင် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်တေ မီးလွင်ႈတုမ်ႉတိူဝ်ႉ ၵမ်းသိုဝ်ႈ တေႃႇ ပၢႆးတူဝ် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ လႄႈ လွင်ႈသိုပ်ႇသၢႆၸႂ် ၽွင်းယၢမ်း ထိင်းသိမ်း လွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ် OXPHOS ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸွမ်းၼင်ႇ ၶေႃႈထၢင်ႇထိူမ်ဢၼ်ၼႆႉသေ ႁဝ်းၶႃႈလႆႈႁၼ်ဝႃႈ ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ PCx ဢၼ်ပဵၼ်ပိူင်လူင်ၼၼ်ႉ မၼ်းလႆႈထုၵ်ႇ ၵုမ်းထိင်းဝႆႉ (Mfn2cKO/CTRL လႅၵ်ႈလၢႆႈ မွၵ်ႈ 1.5 ပွၵ်ႈ၊ ႁၢင်ႈ 3A) ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ပၢႆႇရူဝ်ႇဝႅတ်ႉ လႅၵ်ႈလၢႆႈပဵၼ် ဢွၵ်ႉသထရီႇဝႅတ်ႉ (28) ဢၼ်ယုမ်ႇယမ်ဝႃႈ ပဵၼ်ၼႂ်း brain, 30)။ ဢၼ်ၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်တင်း ၶေႃႈတွပ်ႇ ပရူဝ်ႇတိၼ်းၼၼ်ႉသေ မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်မီးတီႈလဵဝ်ၼၼ်ႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ PCx ၼႆႉ မၼ်းတိူဝ်းမႃး တီႈ PNs ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼၼ်ႉသေ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ PCx ၼႆႉ မၼ်းလႆႈထုၵ်ႇ ႁႄႉႁၢမ်ႈဝႆႉ တီႈသႄးလ် Bergmann glial ဢၼ်တိတ်းၸပ်းၵၼ်ၼၼ်ႉ (ႁၢင်ႊ 3B)။ တႃႇတေထတ်းတူၺ်း လွင်ႈႁဵတ်းသၢင်ႈ PCx ဢၼ်လႆႈႁၼ်ၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈယူတ်းယႃပၼ် ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ပဵၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉ လူၺ်ႈ [1-13C]pyruvate tracer ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ မိူဝ်ႈ pyruvate လႆႈထုၵ်ႇ pyruvate dehydrogenase (PDH) ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢွၵ်ႇသီႇၵျိၼ်ႇၼၼ်ႉ ႁၢႆၵႂႃႇ ၵူၺ်းၵႃႊ မၼ်းလႆႈၶဝ်ႈပႃးၼႂ်း ပၼ်ႇၶွပ်ႈ TCA ဢၼ်ပဵၼ် ၵၢင် မိူဝ်ႈ pyruvate လႆႈထုၵ်ႇ လႅၵ်ႈလၢႆႊ လူၺ်ႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ (ႁၢင်ႊ 3D) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တွၼ်ႈတႃႇတေၵမ်ႉထႅမ်ၶေႃႈမုၼ်း ပရူဝ်ႇတိၼ်းႁဝ်းၼၼ်ႉ ႁဝ်းလႆႈႁၼ် ၶေႃႈမၢႆတွင်း ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၶိူင်ႈၸွပ်ႇဢၼ်ၼႆႉ တင်းၼမ်တင်းလၢႆ တီႈၼႂ်း aspartic acid ၶွင် Mfn2cKO slices ၼၼ်ႉသေ ၽွင်းမိူဝ်ႈ ဢႅတ်ႉသိတ်ႉ citric လႄႈ malic acid ၸိူဝ်းၼၼ်ႉၵေႃႈ မီးလွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်ပဵင်းပေႃးၼၼ်ႉယူႇ၊ ပႅၵ်ႉသမ်ႉဝႃႈ ဢမ်ႇပေႃးထၢင်ႇၸႅင်ႈ (ႁၢင်ႈ 3D)။
ၼႂ်းဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ dopamine ၶွင်ၼူ MitoPark ဢၼ်မီး လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ်ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ဢၼ်ပဵၼ်မႃးယွၼ်ႉ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ dopamine ဢၼ်ယႃႉလူႉ လွင်ႈတႅမ်ႈမၢႆၶွင် mitochondrial ၸိူဝ်ႉၽၼ်း A (Tfam) (ႁၢင်ႈ S6B) ၼၼ်ႉ လွင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ PCx ၵေႃႈ လႆႈထုၵ်ႇၵုမ်းထိင်းဝႆႉ လီလီငၢမ်းငၢမ်း (31) ဢၼ်ၼေဝႆႉဝႃႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ acetone acid occurrencerosis ၼႆႉပဵၼ် လွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈ ၶွင်သဵၼ်ႈလိူတ်ႈဢဵၼ်ႁႅင်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ OXPHOS ၼႂ်းတူဝ်ၶိင်း။ ဢၼ်လီမၢႆတွင်းတႄႉ လႆႈႁၼ်ဝႃႈ ဢႅၼ်ႇၸႆး(မ်) ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ပိူၼ်ႈ (32-34) ဢၼ်တေၸၢင်ႊၼေလႆႈ ၼႂ်းဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ၸၢင်ႊၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်တင်း တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈၵႅၼ်ႇၶႅင်ၼၼ်ႉ တေမီးလွင်ႈၵုမ်းထိင်း ၶိုၼ်ႈမႃး ၼႂ်း PNs ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼၼ်ႉ မိူၼ်ၼင်ႇ ပရူဝ်ႇပိၼ်ႇၼိၼ်ႇ-CoA carboxylase (PCC-A)၊ ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် 3 (ME3) ဢၼ်ပိူင်လူင်မၼ်း ပဵၼ်တႃႇ ဢဝ်ၶိုၼ်း ပၢႆႇရူဝ်ႇဝႅတ်ႉ တီႈၼႂ်း မႃႇလႅတ်ႉ (ႁၢင်ႈ 3, A လႄႈ C) (33, 35) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လိူဝ်သေၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈလႆႈႁၼ်ဝႃႈ ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် Pdk3 ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၽွတ်ႉသၽႃးရၢႆႉ လႄႈ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ PDH ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈၼၼ်ႉ ၼမ်မႃးတေႉတေႉ (36) သေ ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် Pdp1 ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ PDH တူင်ႉၼိုင် ဢမ်ႇၼၼ် ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် PDH complex ၼၼ်ႉ ဢမ်ႇႁၼ်လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈသင် (ႁၢင်ႈ 3A)။ ၸွမ်းၼင်ႇ ၼႂ်း Mern2cKO PNs ၼၼ်ႉ လွင်ႈဢၼ် α1 ယူးၼိတ်ႉ α (PDHE1α) ဢၼ်ပဵၼ် တူၼ်ႈယွႆႈ ၶွင် ပၢႆႇရူဝ်ႇဝႅတ်ႉ တီႇႁၢႆႇထရူဝ်ႇၵျိၼ်ႇၼႅတ်ႉ E1 ဢၼ်ပဵၼ် ၶူဝ်းၶွင် PDH ၼႂ်း Ser293 (ဢၼ်ႁူႉဝႃႈ မၼ်းႁႄႉၵင်ႈ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် ၶွင် PDH) ၼၼ်ႉ လႆႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမႃး ( ႁၢင်ႈ S6C) (ႁၢင်ႈ S6C) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ Pyruvate ၼႆႉ ဢမ်ႇမီး သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ဢၼ်ၶဝ်ႈထိုင်လႆႈ။
လိုၼ်းသုတ်းမႃး ႁဝ်းၶႃႈလႆႈႁၼ်ဝႃႈ သဵၼ်ႈတၢင်း super ၶွင် ၵၢၼ်ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ၶူဝ်းၶွင် ဢၼ်မီးၸႂ် ဢၼ်ပဵၼ် serine လႄႈ glycine ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်တင်း ပၼ်ႇၶွပ်ႈ mitochondrial folate (1C) လႄႈ ၵၢၼ်ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ၶူဝ်းၶွင် ဢၼ်မီးၸႂ် proline (ႁၢင်ႈ 1G လႄႈ ႁၢင်ႈ S5C) ၸိူဝ်းၼႆႉ တင်းမူတ်း လႆႈထုၵ်ႇ ၵုမ်းထိင်းဝႆႉ လီလီငၢမ်းငၢမ်း ၸွမ်းၼင်ႇ ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်လႆႈပိုၼ်ၽၢဝ်ႇဝႆႉ ၽွင်းမိူဝ်ႈ ႁဵတ်းၵၢၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တိတ်ႉသျိဝ်း ဢၼ်မီးႁိမ်းႁွမ်းၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢွၵ်းဢေႃ ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လီ (5-7) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈထတ်းသၢင် ဢၼ်ၵမ်ႉထႅမ်ပၼ် ၶေႃႈမုၼ်း ပရူဝ်ႇတိၼ်းၸိူဝ်းၼႆႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ တီႈ PN ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼၼ်ႉ ဢွၵ်းဢေႃဢွၵ်းဢေႃ ၼူၸိူဝ်းဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇ ဢဝ် serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2) ဢၼ်ပဵၼ် ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ ၶွင် ပၼ်ႇၶွပ်ႈ ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီးၼႂ်း ဢွၵ်းဢေႃၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁႅင်းၶၢမ်ႇတူဝ် ဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈ (ႁၢင်ႈ S5D)။ ၼႂ်း 13 CU-glucose-incubated ဢွၵ်းဢေႃဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉ လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈထၢတ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ၼႂ်းတူဝ်ၶိင်း လႆႈမၵ်းမၼ်ႈဝႃႈ လွင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ထၢတ်ႈ serine လႄႈ proline ၼႆႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ လွင်ႈထၢတ်ႈ carbon isoforms လႆၶဝ်ႈမႃး ၼႂ်း serine လႄႈ proline ၼၼ်ႉ တိူဝ်းမႃးၼႆယဝ်ႉ။ (ႁၢင်ႊ S5E) ယွၼ်ႉဝႃႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ ဢၼ် GLS လႄႈ GPT2 ၶဝ် ပၼ်ႁႅင်းၼၼ်ႉ မီးပုၼ်ႈၽွၼ်း တႃႇႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ၵလူဝ်ႇတႅတ်ႉ ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၵလူဝ်ႇတမ်ႇ လႄႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ၼႂ်းၵႄႈ ၵလူဝ်ႇတႅတ်ႉ လႄႈ α-ketoglutarate ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပေႃးမႃးၼိူင်းတူၺ်း လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈၸိူဝ်းၼႆႉၸိုင် လွင်ႈထတ်းသၢင် ပရူဝ်ႇတိၼ်း ၶွင် cerebellar astrocytes ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၼူ Mfn2cKO ဢၼ် PN-specific ၼၼ်ႉ ၼႄဝႃႈ သဵၼ်ႈတၢင်းၸိူဝ်းၼႆႉ (ပႃးတင်း antiperoxidases တင်းမူတ်း) ဢမ်ႇလႅၵ်ႈလၢႆႈ လွင်ႈၼႄဢွၵ်ႇ ဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈၼၼ်ႉ ယွၼ်ႉၼၼ် ၼႄဝႃႈ လွင်ႈၶိုၼ်းၸီႉၼႄ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ထၢတ်ႈၼႆႉ လိူၵ်ႈဢဝ် တႃႇယႃႉပႅတ်ႈ PN တေႃႇထိုင် D (ႁၢင်ႈ S6) ၼႆယဝ်ႉ။
ပေႃးတေလၢတ်ႈႁူဝ်ယွႆႈမၼ်းၸိုင် ၵၢၼ်ထတ်းသၢင်ၸိူဝ်းၼႆႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ ပိူင်ၾၢင် ဢၼ်ပႅၵ်ႇပိူင်ႈၵၼ် တင်း လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ၸူဝ်ႈၶၢဝ်း ၶွင် သဵၼ်ႈတၢင်း ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ၼႂ်း PNs ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပႅၵ်ႉသမ်ႉဝႃႈ လွင်ႈႁဵတ်းသၢင်ႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇၽဵၼ်ႈၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊႁဵတ်းႁႂ်ႈ ပဵၼ်မႃး တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅၼ်ႇၶႅင် လႄႈ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ 1C ၶိုၼ်းမႄးႁဵတ်းၶိုၼ်း (ႁၢင်ႊ 3E လႄႈ ႁၢင်ႊ S5C) လႄႈ တေႃႇထိုင် လွင်ႈလၢမ်းၶၢတ်ႈ ဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊလႆႈ တီႈၼႂ်း လွင်ႈၼေႁၢင်ႊ I လႄႈ IV ၼၼ်ႉသေတႃႉ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ တီႈၼႂ်း ၵၢၼ်ႁူမ်ႈပွင်း serine de novo ၼႆႉ မၼ်းတေ ႁၼ်ၸႅင်ႈမႃး ဝၢႆးလိုၼ်းၼၼ်ႉၵွၺ်း။ လွင်ႈ OXPHOS ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လီ (ႁၢင်ႈ 3E လႄႈ ႁၢင်ႈ S5C)။ လွင်ႈၶူၼ်ႉႁၼ်ၸိူဝ်းၼႆႉ ပိုတ်ႇတီႈပွင်ႇပၼ် လၢႆးႁဵတ်းလၢႆးသၢင်ႈ ဢၼ်ပဵၼ်မႃးယွၼ်ႉ လွင်ႈတဵၵ်းတဵင် ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ (1C cycle) လႄႈ cytoplasmic (serine biosynthesis) တုမ်ႉတွပ်ႇၸွမ်း လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ တီႈသဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၼႂ်းတူင်ႇဝူင်း TCA တႃႇမႄးပိူင်ၾၢင် လွင်ႈထၢတ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
PNs ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ဢၼ်မီးဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊထိင်းသိမ်းလႆႈ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ဢၼ်မီးလွင်ႈ တူင်ႉၼိုင် ၵမ်းၵမ်း လႄႈ လႆႈၶၢမ်ႇ လွင်ႈၶိုၼ်းၵွင်ႉသၢၼ် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈ တႃႇတေ သၢႆႈတႅၼ်းပၼ် လွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ် ၶွင် mitochondrial ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈသွၵ်ႈႁႃႁၼ်ဢၼ်ၼႆႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈမီးလွင်ႈပဵၼ်လႆႈဢၼ်လီၶဝ်ႈၸႂ်ဝႃႈ မိူဝ်ႈလဵဝ်ၼႆႉၵေႃႈ သႄးၸိူဝ်းၼႆႉ ၸၢင်ႈလႆႈႁပ်ႉလွင်ႈၶဝ်ႈၵႄႈၵၢင် လွင်ႈယူတ်းယႃ တႃႇတေထိူင်း ဢမ်ႇၼၼ် ႁႄႉၵင်ႈလွင်ႈဢဵၼ်ႁႅင်းလူႉလႅဝ်ၼၼ်ႉယူႇ။ တူၵ်းလိုၼ်း. ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈၵႄႈလိတ်ႈ လွင်ႈပဵၼ်လႆႈၼႆႉ လူၺ်ႈ လွင်ႈၶဝ်ႈၵႄႈၵၢင် လွတ်ႈလႅဝ်း သွင်ဢၼ်။ ၼႂ်းလွၵ်းလၢႆးဢွၼ်တၢင်းသုတ်းၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈၶူင်သၢင်ႈဢွၵ်ႇ မႅင်းဝၢႆးရၢတ်ႉသ် ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်တင်း ဢႅတ်ႉတီႇၼူဝ်ႇ (AAV) ဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် Cre ၼၼ်ႉ ၼင်ႇႁိုဝ် MFN2 တေၸၢင်ႊလိူၵ်ႈဢဝ် ဢွၵ်ႇမႃး ၼႂ်း PNs ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼႂ်းတူဝ်မီးၸႂ် (ႁၢင်ႈ S7A) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ AAV ဢၼ်ႁဵတ်းပဵၼ်ပိူင် MFN2 လႄႈ ၸိူဝ်ႉၽၼ်းၽူႈတၢင်ႇၶၢဝ်ႇ mCherry (Mfn2-AAV) ၼၼ်ႉလႆႈထုၵ်ႇမၵ်းမၼ်ႈဝႆႉၼ်ႂးၽိင်ႈထုင်းဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇဢၼ်ပဵၼ်ငိူၼ်ႈငဝ်ႈၼ်ႂးထၢတ်ႈဢၼ်ႁဵတ်းႁ်ႂႈ MFN2 လႆႈထုၵ်ႇၼႄဢွၵ်ႇမႃးၼ်ႂးၽၢင်ႁၢင်ႊဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် Cre လႄႈ ၵႄႇသႄႇၶျွတ်ႈပၼ်ပိူင်ၽၢင်ၶွင် mitochondrial ၊ ၵွပ်ႈၼၼ် ႁႄႉၵင်ႈလွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈသၼ်ႇထေႇဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇၼ်ႂး MfnKO, B ႁၢင်ႊ S2c7 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ ႁဵတ်းလွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်း ၼႂ်းတူဝ်ၸႂ် တႃႇတေဢဝ် Mfn2-AAV ဢၼ်ဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ သူင်ႇပၼ် တီႈၼႂ်းဢွၵ်းဢေႃ ၶွင် Mfn2cKO လႄႈ ၼူဢၼ်ၵုမ်းထိင်းဝႆႉၼၼ်ႉသေ ထတ်းသၢင်တူၺ်း ၼူဢၼ်ဢႃႇယု 12 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ (ႁၢင်ႈ 4A)။ ၼူ Mfn2cKO ဢၼ်လႆႈယူတ်းယႃၼၼ်ႉ လႆႈတၢႆၵႂႃႇ (ႁၢင်ႈ 1, A လႄႈ B) (16)။ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ မႅင်းဝၢႆးရၢတ်ႉသ် ၼႂ်းတူဝ်မီးၸႂ်ၼႆႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ PN ဢွၵ်ႇမႃး ဢၼ်လိူၵ်ႈဝႆႉ ၼႂ်းတူင်ႇဝူင်း ဢွၵ်းဢေႃ ၵမ်ႈၽွင်ႈ (ႁၢင်ႊ S7, G လႄႈ H)။ လွင်ႈသမ်းယႃႈယႃ AAV ဢၼ်ၵုမ်းထိင်းဝႆႉ ဢၼ်ၼႄပၼ် mCherry (Ctrl-AAV) ၼၼ်ႉၵူၺ်းၼၼ်ႉ ဢမ်ႇမီးလွင်ႈတုမ်ႉယွၼ်ႈဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈၼိူဝ် ၸၼ်ႉလွင်ႈလူႉလႅဝ်ဢဵၼ်ႁႅင်း တီႈတူဝ်သတ်း Mfn2cKO ၼၼ်ႉ။ ပေႃးမႃးၼိူင်းတူၺ်းၼႆ လွင်ႈထတ်းသၢင် Mfn2cKOs ဢၼ်ဢဝ် Mfn2-AAV သေ လႅၵ်ႈလၢႆႈၼၼ်ႉ ၼႄဝႃႈ ၽွၼ်းလီ ဢၼ်ၵႅတ်ႇၶႄပၼ် သႄးလ် PN ၼၼ်ႉ မီးလွင်ႈထၢင်ႇၸႅင်ႈလီ (ႁၢင်ႈ 4, B လႄႈ C) ၼႆယဝ်ႉ။ တီႈတေႉမၼ်း လွင်ႈၼႅၼ်ႈၼႃ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇၼႆႉ မိူၼ်ၼင်ႇ ဢမ်ႇပေႃးၸႅၵ်ႇၽႄလႆႈ တင်းတူဝ်သတ်း ဢၼ်ၵုမ်းထိင်းဝႆႉၼၼ်ႉ (ႁၢင်ႈ 4, B လႄႈ C လႄႈ ႁၢင်ႈ S7, H လႄႈ I)။ လွင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ MFN1 ၵူၺ်းၵႃႈ ဢမ်ႇၸႂ်ႈ MFN2 ၼႆႉ မီးၽွၼ်းလီမိူၼ်ၵၼ် တႃႇၵႅတ်ႇၶႄပၼ် လွင်ႈတၢႆ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ (ႁၢင်ႈ 4C လႄႈ ႁၢင်ႈ S7, C လႄႈ F) ဢၼ်ၼႄဝႃႈ လွင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ectopic MFN1 ၼႆႉ ၸၢင်ႈၽိူမ်ႉထႅမ်ပၼ် လွင်ႈဢမ်ႇမီး MFN2 ၼၼ်ႉ လီလီယူႇ။ လွင်ႈထတ်းသၢင်ထႅင်ႈ တီႈၸၼ်ႉ PN ဢၼ်လဵဝ်ၼၼ်ႉ ၼႄဝႃႈ Mfn2-AAV ၼႆႉ ၵမ်ႈၼမ် ၵႅတ်ႇၶႄပၼ် လွင်ႈၵေႃႇသၢင်ႈ ultrastructure ၶွင် mitochondria ၊ ပေႃးဢဝ်တႃတူၺ်း ၼူ Mfn2cKO ဢၼ်လႆႈၵႄႇသႄႇၼႄႇ ၼႂ်းသၢႆငၢႆလိုဝ်ႈသဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈႁၼ်ဝႃႈ လွင်ႈၼင်ႈ လႄႈ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် (လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် S1 တေႃႇထိုင် S3) ၶဝ် ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမႃးၼႆယဝ်ႉ။ ၼႂ်းၶေႃႈလူပ်းလင်မၼ်း လွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်းၸိူဝ်းၼႆႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ လွင်ႈၶိုၼ်းဢဝ် MFN2 ၶဝ်ႈမႃးၼႂ်း PNs ဢၼ်ႁၢမ်း OXPHOS ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉ မၼ်းၵုမ်ႇထူၼ်ႈတႃႇတေ ၶိုၼ်းၸႂ်ႉတိုဝ်း mtDNA လႄႈ ႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ် တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈၵႅပ်ႈ ၼႆသေ ႁႄႉၵင်ႈပၼ် လွင်ႈ axon လူႉလႅဝ်လႄႈ လွင်ႈတၢႆ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼႂ်းတူဝ်မီးၸႂ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
(A) လွၵ်းလၢႆးဢၼ်ၼႄပၼ် ၶၢဝ်းယၢမ်းၸၢမ်းတူၺ်း တႃႇသမ်း AAV ဢၼ်ႁဵတ်းပဵၼ် ၶူတ်ႉ MFN2 မိူဝ်ႈသဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်ၼႄဝႆႉ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ထၢတ်ႈၼၼ်ႉ ႁဵတ်းၵၢၼ်။ (B) ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်တၢင်တူဝ် ပွတ်းတွၼ်ႈ ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီးဢႃႇယု 12 ဝူင်ႈ ဢၼ်ဢဝ် ၼူ Mfn2cKO သေ လႅၵ်ႈလၢႆႊ မိူဝ်ႈ 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉသေ လႆႈတၢင်ႇဝႆႉ ၶူဝ်ႈၶွင် ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ ၶႄႇလ်ပိၼ်ႇတိၼ်ႇ ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၽၢႆႇၶႂႃ - လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ သဵၼ်ႈသၢႆ axon ။ တၢင်းယႂ်ႇ ဢႅၵ်ႉသၼ်ႇ ၸူမ်းၼႆႉ ပဵၼ် 450 လႄႈ 75 μm ယဝ်ႉ။ (C) ၽၢႆႇသၢႆႉ - လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ တၢင်းၼမ် သႄးလ် Purkinje ၼႂ်းလွၵ်းလၢႆး လႅၵ်ႈလၢႆႈ AAV (AAV+) (လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ တၢင်းလဵဝ်၊ n = 3 ၼူ)။ ၽၢႆႇၶႂႃ: လွင်ႈထတ်းသၢင် mtDNA ဢၼ်ပၵ်းၸႂ်ဝႆႉ ၼႂ်း PN ဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊဝႆႉ မိူဝ်ႈဝူင်ႈတီႈ 12 (လွင်ႈထတ်းသၢင် t ဢၼ်ဢမ်ႇမီးၵူႈၵၼ်၊ n = 6 သႄးလ် ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၼူသၢမ်တူဝ်)။ * ၽ <0.05၊ ** ၽ <0.01။ (D) ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်တၢင်တူဝ် လွင်ႈသူင်ႇၶၢဝ်ႇ ဢီႇလႅတ်ႇထရွၼ်ႇ ဢၼ်လဵၵ်ႉၼွႆႉ ၶွင် PNs ၶွင် တွၼ်ႈဢွၵ်းဢေႃ Mfn2cKO ဢၼ်သူင်ႇၶၢဝ်ႇၸွမ်း မႅင်းဝၢႆးရၢတ်ႉသ် ဢၼ်ၼႄဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၽႃႈတူမ်းသူပ်းသီၶဵဝ်ၼၼ်ႉ ၼႄပၼ် ပိုၼ်ႉတီႈ ဢၼ် dendrites ၶဝ် ၵုမ်းၵမ်ဝႆႉၼၼ်ႉသေ သီလိူင် ဢၼ်မီး ၸုတ်ႇၸုတ်ႇၼၼ်ႉ ၼႄပၼ် လွင်ႈ Zoom ဢၼ်ပၼ်ဝႆႉ ၽၢႆႇၶႂႃၼၼ်ႉ၊ n ၼႆႉ တၢင်တူဝ် ၼယူးၵရီးယႃး။ သၵႄးလ် 1μm ။ (E) ၼႄတူဝ်ယၢင်ႇ လွင်ႈဢၼ် PCx ႁဵတ်းႁႂ်ႈ PN လႅၵ်ႈလၢႆႈ မိူဝ်ႈ 12 ဝူင်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ သၵႄးလ် 20μm ။ OE လွင်ႈၼႄၼမ်ႉၼႄတူဝ်လိူဝ်၊ FC, လႅၵ်ႈလၢႆႈၽိုၼ်။
လိုၼ်းသုတ်း ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈထတ်းသၢင်တူၺ်း လွင်ႈလမ်ႇလွင်ႈ လွင်ႈသိုပ်ႇသၢႆၸႂ် သႄးလ် ဢၼ်ပဵၼ်မႃးယွၼ်ႉ peroxidase ၼႂ်း PNs ဢၼ်လႆႈထူပ်းၺႃး လွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ် OXPHOS ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁဝ်းၶႃႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ mCherry ဢၼ်ႁဵတ်းပဵၼ် AAV-shRNA (RNA ဢၼ်မီးၶူၼ်ႁူဝ်ပွတ်း) ဢၼ်ယိူင်းၸူး PCx mRNA ၼူ (AAV-shPCx) ၼၼ်ႉတႅတ်ႈတႅတ်ႈတေႃးတေႃးသေ သမ်းပၼ် မႅင်းဝၢႆးရၢတ်ႉသ် ဢမ်ႇၼၼ် လွင်ႈၵုမ်းထိင်းမၼ်း (AAV-scr) တီႈၼႂ်းဢွၵ်းဢေႃဢွၼ်ႇၶွင် ၼူ Mfn2cKO ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈသမ်းယႃႈယႃၼႆႉ လႆႈႁဵတ်းမိူဝ်ႈဢႃႇယု 4 ဝူင်ႈ (ႁၢင်ႈ 5A) တႃႇႁႂ်ႈလႆႈ PCx knockdown ဢၼ်မီးၽွၼ်းလီ ၽွင်းၶၢဝ်းယၢမ်း PCx ဢွၵ်ႇမႃးၼမ်မႃး (ႁၢင်ႈ 3C) လႄႈ ထၢပ်ႈသႄး PN တိုၵ်ႉမီးဝႆႉ (ႁၢင်ႈ 1A) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢၼ်လီမၢႆတွင်းတႄႉ ပေႃးယႃႉပႅတ်ႈ PCx (ႁၢင်ႈ S8A) ၼႆႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈတၢႆ PN ၼၼ်ႉ ဝႆးမႃး တေႉတေႉဝႃႈဝႃႈ ဢၼ်ပဵၼ် ဝူင်းဢၼ်ႁႄႉႁၢမ်ႈ လွင်ႈၸပ်းတၢင်းပဵၼ် ဢၼ်လဵဝ်ၵွႆး (ႁၢင်ႈ 5, B လႄႈ C) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼင်ႇႁိုဝ် တေပွင်ႇၸႂ်လႆႈ လၢႆးႁဵတ်းသၢင်ႈ ၽွၼ်းယွၼ်ႈ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢၼ် PCx ၶိုၼ်ႈမႃးၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈလဵပ်ႈႁဵၼ်း ၸၼ်ႉထၢၼ်ႈ redox ၶွင် PNs ဝၢႆးသေ PCx လႆႈထုၵ်ႇယႃႉပႅတ်ႈ လႄႈ ၶိူင်ႈၸွပ်ႇ သၢႆလႅင်း ဢၼ်ပဵၼ် ၵႄႈၵၢင် AAV Grx1-roGFP2 ၼၼ်ႉ လႆႈၼႄဢွၵ်ႇမႃး မိူဝ်ႈလဵဝ်ၵၼ် (ႁၢင်ႈ S8, B တေႃႇထိုင် D) တႃႇထတ်းသၢင် ၵလူဝ်ႇတႃႇထီႇယွၼ်ႇ ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်တင်း ပႅတ်ႉထီႇယွၼ်ႇ 8 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈႁဵတ်း လွင်ႈထတ်းတူၺ်း ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်လႅင်း သွင်ၽူဝ်ႇတၼ်ႇ (FLIM) တီႈၼႂ်း ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်း ၶွင် Mfn2cKO ဢၼ်မီးဢႃႇယု 7 ဝူင်ႈ ဢမ်ႇၼၼ် ၵုမ်းထိင်း littermates တႃႇႁႃႁၼ် လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်ၸၢင်ႊပဵၼ်လႆႈ ၼႂ်းၸၼ်ႉ cytoplasmic redox ဝၢႆးသေ မၵ်းမၼ်ႈ ငဝ်းလၢႆး FLIM (ႁၢင်ႈ S8, E တေႃႇထိုင် G) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈထတ်းသၢင်ၼႆႉ ၼႄဝႃႈ လွင်ႈဢွၵ်ႇသီႇၵျိၼ်ႇ ဢၼ်ပဵၼ်မႃး တီႈ Mfn2cKO PNs ဢၼ်လဵဝ် ဢၼ်ဢမ်ႇမီး လွင်ႈၼႄ PCx ၼၼ်ႉ တိူဝ်းမႃး တေႉတေႉဝႃႈဝႃႈသေ ဢၼ်ပိူင်ႈၵၼ်တင်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ၵုမ်းထိင်း ဢမ်ႇၼၼ် Mfn2cKO PNs ဢၼ်ၼႄ shRNA ဢၼ်ၶူၼ်းၶဝ်းလေႃးၵၼ်ဝႆႉၼၼ်ႉၵွၺ်း (ႁၢင်ႈ 5, D လႄႈ E)။ မိူဝ်ႈ PCx ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ လႆႈထုၵ်ႇ ၵုမ်းထိင်းလူင်းၼၼ်ႉ ႁူဝ်ပၢၵ်ႇ Mfn2cKO PNs ဢၼ်ၼေဝႆႉ ငဝ်းလၢႆး ဢွၵ်ႇသီႇၵျိၼ်ႇ ၼမ်ၼၼ်ႉ တိူဝ်းမႃး သၢမ်ပုၼ်ႈလိူဝ်လိူဝ် (ႁၢင်ႊ 5E) ဢၼ်ၼေဝႆႉဝႃႈ လွင်ႈၵုမ်းထိင်း PCx ၶိုၼ်ႈမႃးၼၼ်ႉ ထိင်းသိမ်းပၼ် ၼမ်ႉၵတ်ႉ redox ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်လူႉလႅဝ်ၵႂႃႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
(A) လွၵ်းလၢႆးဢၼ်ၼႄပၼ် ၶၢဝ်းယၢမ်းၸၢမ်းတူၺ်း တႃႇသမ်း AAV ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ shPCx ပဵၼ်ၶူတ်ႉ မိူဝ်ႈသဵၼ်ႈတၢင်း ဢၼ်ၼႄဝႆႉ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ထၢတ်ႈၼၼ်ႉ ႁဵတ်းၵၢၼ်။ (B) ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်တၢင်တူဝ် ပွတ်းတွၼ်ႈ ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီးဢႃႇယု 8 ဝူင်ႈ တီႈၼူ Mfn2cKO ဢၼ်လႆႈ လႅၵ်ႈလၢႆႈ လႄႈ တၢင်ႇမၢႆဝႆႉ တင်း ၶူဝ်ႈၶွင် ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ ၶႄႇလ်သီႇၼူဝ်ႇရီႇ မိူဝ်ႈ 4 ဝူင်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ သၵႄးလ် 450μm ။ (C) လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ တၢင်းၼႅၼ်ႈၼႃ သႄးလ် Purkinje ၼႂ်းလွၵ်းဢၼ် AAV လႅၵ်ႈလၢႆႊဝႆႉ (လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ ဢၼ်မီးတၢင်းလဵဝ်၊ n = 3 တေႃႇထိုင် 4 ၼူ)။ ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်ၼႄဝႆႉ ပဵၼ် mean±SEM ၊ ***ၽ<0.001။ (D) ၶႅပ်းႁၢင်ႈ FLIM ဢၼ်တၢင်တူဝ်ၼၼ်ႉ ၼႄပၼ် ဢသၢၵ်ႈၽတ်ႉၽဵင်ႇ PN ဢၼ်မီးဢႃႇယု 7 ဝူင်ႈ ဢၼ်ၼႄပၼ် ၶိူင်ႈၸွပ်ႇ ၵလူဝ်ႇတႃႇထီႇယွၼ်ႇ ရီႇတၵ်ႉသ် Grx1-roGFP2 ၽၢႆႇတႂ်ႈ ငဝ်းလၢႆး ဢၼ်ၸၢမ်းတူၺ်း ဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ LUT (လွၵ်းတူၺ်း) တၢင်းၼမ် : ၶၢဝ်းယၢမ်းၵႄႈၵၢင် တႃႇသိုပ်ႇမီးၸႂ် (ၼႂ်း ပိၵ်ႉၵူဝ်ႇသီႇၵိၼ်ႇ)။ သၵႄးလ် 25μm ။ (E) ႁိတ်ႉသထရမ်ႇၼႆႉ ၼႄဝႆႉ လွင်ႈၽႄႈၸွတ်ႇ ၵႃႊၶၼ် ၸူဝ်ႈပၢၼ် Grx1-roGFP2 ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ (D) (n=158 တေႃႇထိုင် 368 သႄးလ် ၼႂ်းၼူသွင်တူဝ် ဢၼ်မီးတႂ်ႈ ငဝ်းလၢႆး ဢၼ်လႂ်ဢၼ်ၼၼ်ႉ) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၽႅၼ်ႇလိၼ် ဢၼ်မီးၽၢႆႇၼိူဝ် ႁိတ်ႉသတူဝ်ႇၵရမ်ႇ ၵူႊဢၼ်ဢၼ်ၼၼ်ႉ ၼႄပၼ် တၢင်းၼမ် သႄးလ် ဢၼ်မီး ၵႃႊၶၼ် ဢသၢၵ်ႈယၢဝ်းလိူဝ် (သီလႅင်၊ ဢွၵ်ႇသီႇၵျိၼ်ႇ) ဢမ်ႇၼၼ် ပွတ်းလိူဝ် (သီသွမ်ႇ၊ ယွမ်းလူင်း) ဢၼ်ပူၼ်ႉလိူဝ် 1 SD ၶွင် ၵႃႊၶၼ် ဢသၢၵ်ႈၽတ်ႉၽဵင်ႇ ၼႂ်း CTRL-AAV-scr ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ (F) ပိူင်ဢၼ်တၢင်ႇၼႄဝႆႉၼၼ်ႉ ၼႄပၼ် ၽွၼ်းလီ ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇၶွင် PCx ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ပေႃးဢဝ်တင်းမူတ်းဝႃႈၸိုင် ၶေႃႈမုၼ်းဢၼ်ႁဝ်းၶႃႈ ပၼ်မႃးတီႈၼႆႈၼႆႉ ၼႄဝႃႈ လွင်ႈၶိုၼ်းႁဵတ်းဢွၵ်ႇ MFN2 ၼႆႉ ၸၢင်ႊၵႄႇသႄႇၼႄႇ PN ဢၼ်ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမႃး ဢၼ်မီး လွင်ႈႁၢမ်း OXPHOS ႁၢဝ်ႈႁႅင်း၊ လွင်ႈလူႉလႅဝ် ဢဵၼ်ႁႅင်းၼႆႉ ပၼ်လၵ်းထၢၼ် ဢၼ်ၸၢင်ႊၶိုၼ်းလႆႈ ၸၼ်ႉထၢၼ်ႈ မိူဝ်ႈပႆႇတၢႆ သႄးလ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၸၼ်ႉၼႆႉ လႆႈဝႆႉၼၵ်းၼႃ လူၺ်ႈ ၼမ်ႉၵတ်ႉ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ တႃႇႁဵတ်းႁႂ်ႈ သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅပ်ႈ (လွင်ႈၶိုၼ်းႁဵတ်းႁႂ်ႈ ပၼ်ႇၶွပ်ႈ TCA ပဵၼ်မႃး) ဢၼ်ႁႄႉႁၢမ်ႈ လွင်ႈ PCx ဢွၵ်ႇမႃး တီႈ PNs ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS လႄႈ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ သႄးလ် တၢႆၵႂႃႇ လႄႈ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ တွမ်ႇတွမ်ႊ ၵႅတ်ႇၶႄလႆႈ (ႁၢင်ႊ 5F)။
ၼႂ်းၵၢၼ်လဵပ်ႈႁဵၼ်းဢၼ်ၼႆႉ ႁဝ်းၶႃႈလႆႈပၼ်လၵ်းထၢၼ်ဝႃႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇၶွင် PNs တေႃႇလွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ် OXPHOS ၼၼ်ႉ ပဵၼ်လွင်ႈဢၼ်တေမႃးႁူမ်ႈၵၼ်လွႆးလွႆး တီႈ TCA cycle atherosclerosis လူၺ်ႈသဵၼ်ႈတၢင်းလွင်ႈတူင်ႉၼိုင်ဢၼ်ပႅၵ်ႇပိူင်ႈၵၼ် ဢၼ်တူင်ႉၼိုင်လူၺ်ႈ ပရူဝ်ႇၵရႅမ်ႇ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈထၢတ်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈမၵ်းမၼ်ႈ လွင်ႈထတ်းသၢင် ပရူဝ်ႇတိၼ်း လူၺ်ႈလွၵ်းလၢႆး ဢၼ်တဵမ်ထူၼ်ႈ တင်းၼမ်သေ ပိုၼ်ၽၢဝ်ႇဝႃႈ မိူဝ်ႈၶဵင်ႇတႃႉ လူၺ်ႈ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ် ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ၶွင် mitochondrial ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ မီးပိူင်ၾၢင် ဢၼ်ဢမ်ႇႁူႉဝႆႉ မိူဝ်ႈဢွၼ်တၢင်း ဢၼ်ပဵၼ် လွင်ႈယိုတ်ႈယၢဝ်း ၶွင် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢၼ်ႁဝ်းတေဢၢမ်းတႄႉ လၢႆးႁဵတ်းလၢႆးသၢင်ႈ တင်းမူတ်းၼႆႉ ဢမ်ႇတၢပ်ႈလူဝ်ႇ မၢႆဝႆႉ ၸၼ်ႉထၢၼ်ႈ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ဢၼ်ၸွမ်းမႃး လွႆးလွႆး လႄႈ ဢမ်ႇၸၢင်ႊၶိုၼ်းမႄးလႆႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵူၺ်းၵႃႊ ၶေႃႈမုၼ်းႁဝ်း ပၼ်တၢင်းၶႆႈၸႂ်ဝႃႈ မၼ်းတေၸၢင်ႊ ပဵၼ်မႃး ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ထိင်းသိမ်းလႆႈ တေႃႇထိုင် ၸၼ်ႉထၢၼ်ႈ မိူဝ်ႈပႆႇတၢႆၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၶူၼ်ႉႁၼ်ဢၼ်ၼႆႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇၼႆႉ မီးလွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼႂ်းတူဝ်ၶိင်း တင်းၼမ်ၼႆယဝ်ႉ။ လွင်ႈၼႆႉ ၼႄလၵ်းထၢၼ်ဝႃႈ ဝၢႆးလိုၼ်းမႃး လွင်ႈၶိုၼ်းဢဝ် MFN2 မႃးၸႂ်ႉတိုဝ်းၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈၼႄ ၶေႃႈမၢႆတွင်း ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ ဢၼ်ပဵၼ် လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈၼၼ်ႉ ၶိုၼ်းလီမႃးသေ ႁႄႉၵင်ႈပၼ် လွင်ႈ PN လူႉလႅဝ်ၵႂႃႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပိူင်တႅၵ်ႈမၼ်း မၼ်းႁႄႉၵင်ႈပၼ် တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ လႄႈ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢဵၼ်သၢႆၸႂ် ဝႆးမႃး။ ၵူၼ်းလႅၵ်ႈလၢႆႈလိူတ်ႈ။
လွင်ႈၶူၼ်ႉႁၼ် ဢၼ်လီၶဝ်ႈၸႂ်လိူဝ်ပိူၼ်ႈ ဢၼ်ၼိူင်ႈ ၼႂ်းၵၢၼ်ၶူၼ်ႉၶႂႃႉႁဝ်းၼႆႉ ပဵၼ်ဝႃႈ PNs ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊမူၼ်ႉမႄးလႆႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ TCA လူၺ်ႈ လွင်ႈၵုမ်းထိင်း ဢႅၼ်ႇၸႆး(မ်) ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅပ်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၶိုၼ်းၶပ်ႉၶိုင် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼႆႉ ပဵၼ်ၽၢင်ႁၢင်ႊ ဢၼ်ၵႆႉပဵၼ် တီႈ သႄးလ် ၶႅၼ်ႇသိူဝ်ႇၶဝ်သေ ၵမ်ႈၽွင်ႈ လႆႈပိုင်ႈဢိင် ၼိူဝ် ၵလူဝ်ႇတမ်ႇ တႃႇၽိူမ်ႉထႅမ်ပၼ် ပၼ်ႇၶွပ်ႈ TCA တႃႇႁဵတ်းဢွၵ်ႇ လွင်ႈလူတ်းယွမ်း ဢၼ်ၽဵင်ႇပဵင်းၵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵၢၼ်လဵပ်ႈႁဵၼ်းဢၼ်ၼိုင်ႈ ဢၼ်လႆႈႁဵတ်းမႃး မိူဝ်ႈပူၼ်ႉမႃးၼႆႉ ၼႄဝႃႈ တီႈၼႂ်း တိတ်ႉသျူး ၽၢႆႇၼွၵ်ႈ ဢၼ်လႆႈထူပ်းၺႃး လွင်ႈဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ် OXPHOS ၼၼ်ႉ လွင်ႈၶိုၼ်းၵွင်ႉသၢၼ် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႈ ၵလူဝ်ႇတမ်ႇ/ၵလူဝ်ႇတမ်ႇ ၼၼ်ႉၵေႃႈ ပဵၼ်လွင်ႈဢၼ် ထၢင်ႇၸႅင်ႈ (5, 41) တီႈဢၼ် တၢင်းၵလူဝ်ႇတမ်ႇ ၶဝ်ႈမႃး ၼႂ်းပၼ်ႇႁွပ်ႈ TCA ၼၼ်ႉ ဢိင်ၼိူဝ် ယွၼ်ႉပိူဝ်ႈ လွင်ႈၸဵပ်းသႅပ်ႇ OXPHOS ႁၢဝ်ႈႁႅင်း (41) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ). ၵူၺ်းၵႃႊ မၼ်းဢမ်ႇမီး လၵ်းထၢၼ် ဢၼ်ၸႅင်ႈလႅင်း ၼိူဝ် လွင်ႈမိူၼ်ၵၼ် ဢၼ်ပဵၼ် လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼႂ်းတူဝ်ၶိင်း လႄႈ လွင်ႈၵွင်ႉၵၢႆႇ ဢၼ်ၸၢင်ႊပဵၼ်လႆႈ ၼႂ်းၶၵ်ႉတွၼ်ႈ တၢင်းပဵၼ်ၼၼ်ႉ။ ၼႂ်းၵၢၼ်လဵပ်ႈႁဵၼ်း ဢၼ်ပႆႇႁိုင်ၼႆႉ လႆႈၼေဝႆႉဝႃႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ပိုၼ်ႉထၢၼ်ႈၼႆႉ မၼ်းၸုတုမ်လႆႈ ၼမ်ႉ glutamate တႃႇ ၵၢၼ်သူင်ႇၶၢဝ်ႇ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼႆယဝ်ႉ။ ယွၼ်ႉၼၼ် မၼ်းႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢွၵ်ႇသီႇတဵင်း လႄႈ တၢင်းပဵၼ် သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅပ်ႈ ၽၢႆႇတႂ်ႈ ငဝ်းလၢႆး လွင်ႈတဵၵ်းတဵင် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢဵၼ်ႁႅင်း (42) ၼႆယဝ်ႉ။ ဢၼ်လီမၢႆတွင်းတႄႉ ၽၢႆႇတႂ်ႈ လွင်ႈႁႄႉႁၢမ်ႈ ပၢႆးယႃႈယႃ ၶွင် ဢႅၼ်ႇၸႆးမ် သုၵ်ႉသၵ်ႉၼိတ်ႉ တီႇႁၢႆႇထရူဝ်ႇၵျိၼ်ႇ ပၼ်ႇႁွပ်ႈ TCA ၼၼ်ႉ ယုမ်ႇယမ်ဝႃႈ ပၢႆႇရူဝ်ႇဝႅတ်ႉ ၶႃႇပၢၵ်ႇသီႇလႅၼ်ႇ တေထိင်းသိမ်း လွင်ႈႁူမ်ႈပွင်း ဢွၵ်ႇသႃႇလူဝ်ႇဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ၼႂ်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၵရႅၼ်ႇၼူဝ်ႇ ဢၼ်ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ ၼႂ်းဢွၵ်းဢေႃ (34) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵူၺ်းၵႃႈ လွင်ႈၵွင်ႉၵၢႆႇ ၽၢႆႇပၢႆးတူဝ် ၶွင်လွၵ်းလၢႆးၸိူဝ်းၼႆႉ တင်း တိတ်ႉသျူးဢွၵ်းဢေႃ (တီႈဢၼ် တၢင်းပဵၼ် atherosclerosis ၼႆႉ ယုမ်ႇယမ်ဝႃႈ ပိူင်လူင်မၼ်း ပဵၼ်တီႈ astrocytes) ၼၼ်ႉ တိုၵ်ႉမီးလွင်ႈလမ်ႇလွင်ႈ ၽၢႆႇပၢႆးတူဝ် (43) ယူႇ။ ၼႂ်းလွင်ႈၼႆႉ ၶေႃႈမုၼ်းႁဝ်းၶႃႈ ၼႄဝႃႈ PNs ဢၼ် OXPHOS ႁဵတ်းႁႂ်ႈလူႉလႅဝ် ၼႂ်းတူဝ်ၶိင်းၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊလႅၵ်ႈလၢႆႈပဵၼ် လွင်ႈယႃႉလူႉ BCAA လႄႈ လွင်ႈ pyruvate carboxylation ဢၼ်ပဵၼ် ငဝ်ႈငႃႇပိူင်လူင် သွင်ဢၼ် တႃႇၽိူမ်ႉထႅမ် ၶူဝ်းၶွင် ဢၼ်မီးၼႂ်းၵႄႈ TCA pool ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပႅၵ်ႉသမ်ႉဝႃႈ လွင်ႈၵမ်ႉၸွၺ်ႈ ဢၼ်ထၢင်ႇထိူမ်ဝႆႉ ၶွင် BCAA catabolism တေႃႇ လွင်ႈထၢတ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢဵၼ်ႁႅင်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼၼ်ႉ လႆႈတၢင်ႇၼေဝႆႉသေတႃႉ လိူဝ်သေ ပုၼ်ႈၽွၼ်း glutamate လႄႈ GABA တႃႇ ၵၢၼ်သူင်ႇၶၢဝ်ႇ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ (44) ၼၼ်ႉ မၼ်းတိုၵ်ႉပႆႇမီး လၵ်းထၢၼ် တေႃႇ လွၵ်းလၢႆးၸိူဝ်းၼႆႉ ၼႂ်းတူဝ်မီးၸႂ်ၼၼ်ႉ။ ယွၼ်ႉၼၼ် မၼ်းငၢႆႈတႃႇတေထၢင်ႇထိူမ်ဝႃႈ PNs ဢၼ်ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈၼၼ်ႉ ၸၢင်ႈသၢႆႈတႅၼ်းပၼ် လွင်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶူဝ်းၶွင်ၵၢင် TCA ဢၼ်ၶိုင်ပွင်လူၺ်ႈ လၢႆးႁဵတ်းသၢင်ႈ လွင်ႈၸုပ်ႇၶဝ်ႈ လူၺ်ႈ လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ၵႅပ်ႈမႃးၼၼ်ႉ ႁင်းမၼ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈတေႉမၼ်း လွင်ႈၵုမ်းထိင်း PCx ၼႆႉ မၼ်းတေလႆႈ ထိင်းသိမ်းလႆႈ လွင်ႈလူဝ်ႇ aspartic acid ဢၼ်ၼေဝႆႉ တီႈၼႂ်း သႄးလ် ဢၼ်ၽႄႈတိူၼ်း လူၺ်ႈ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ် ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ၶွင် mitochondrial (45) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵူၺ်းၵႃႊ ၵၢၼ်ထတ်းၸႅတ်ႈတေႃႇ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼႂ်းတူဝ်ႁဝ်းၼႆႉ ဢမ်ႇၼေလႆႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈ တီႈၸၼ်ႉၼိမ်သဝ်း ၶွင် aspartic acid ၼႂ်း Mfn2cKO PNs (ႁၢင်ႊ S6A) ဢၼ်လႅပ်ႈတေ ၼေပၼ် လွင်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼႂ်းၵေႈ သႄးလ် ဢၼ်ၽႄႈတိူၼ်း လႄႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ပဵၼ်မႃး ဝၢႆး mitotic ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပႅၵ်ႉသမ်ႉဝႃႈ လွၵ်းလၢႆးဢၼ်တႅတ်ႈၼႅတ်ႈ ၶွင် PCx upregulation တီႈၼႂ်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈ ၼႂ်းတူဝ်မီးၸႂ်ၼၼ်ႉ တိုၵ်ႉတေလႆႈ ၼႄပိူင်ၾၢင်မၼ်းယူႇသေတႃႉ ႁဝ်းၶႃႈ ၼေဝႆႉဝႃႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇပႆႇထိုင်ၶၢဝ်းယၢမ်းၼႆႉ မၼ်းလဵၼ်ႈပဵၼ် ပုၼ်ႈၽွၼ်းလမ်ႇလွင်ႈ တႃႇထိင်းသိမ်း ငဝ်းလၢႆး redox ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်လႆႈၼေဝႆႉ တီႈၼႂ်း လွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်း FLIM ၼိူဝ် ပွတ်းတွၼ်ႈ ဢွၵ်းဢေႃၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈတေႉမၼ်း လွင်ႈႁႄႉၵင်ႈ PNs တီႈ PCx ဢၼ်ၵုမ်းထိင်းလႆႈၼၼ်ႉ ၸၢင်ႊႁဵတ်းႁႂ်ႈ ငဝ်းလၢႆး ဢွၵ်ႇသီႇၵျိၼ်ႇ ၼမ်မႃးသေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ သႄးလ် တၢႆဝႆးဝႆးၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ BCAA ယွမ်းလူင်း လႄႈ လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ ထၢတ်ႈ carboxylation ၶွင် pyruvate ၼၼ်ႉ ဢမ်ႇၸႂ်ႈလၢႆးတၢင်း တႃႇတေ ၼႄပၼ် ၽၢင်ႁၢင်ႊ တိတ်ႉသျူး ၽၢႆႇၼွၵ်ႈ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ် ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ၶွင် ဢဵၼ်ႁႅင်း (7) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ယွၼ်ႉၼၼ် ၶဝ်ၼႆႉ မိူၼ်ၼင်ႇ ပဵၼ်ၽၢင်ႁၢင်ႈ ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ တႃႇ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇမီး OXPHOS ၼၼ်ႉ ပႅၵ်ႉသမ်ႉဝႃႈ ဢမ်ႇၸႂ်ႈ ၽၢင်ႁၢင်ႈဢၼ်လဵဝ် ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ တႃႇ လွင်ႈဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ လူႉလႅဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ။
တၢင်းပဵၼ် ဢွၵ်းဢေႃ ၼႆႉ ပဵၼ်တၢင်းပဵၼ် ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ၵၼ် ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢဵၼ်ႁႅင်း လူႉလႅဝ်သေ ၵႆႉၼႄတူဝ် မိူၼ်ၼင်ႇ တၢင်းပဵၼ် ataxia သေ ၵႆႉယႃႉလူႉ PNs (46) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁူဝ်ၼပ်ႉဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇၼႆႉ မၼ်းမီးလွင်ႈတုမ်ႉတိူဝ်ႉတေႃႇ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ်ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈ ၶွင် mitochondrial ယွၼ်ႉဝႃႈ လွင်ႈလူႉလႅဝ် ဢၼ်ၶဝ်လိူၵ်ႈဝႆႉ တီႈၼူၼၼ်ႉ မၼ်းၵုမ်ႇထူၼ်ႈတႃႇတေ ႁဵတ်းဢွၵ်ႇၶိုၼ်း ၾၢင်ႁၢင်ႊတၢင်းပဵၼ် ဢၼ်ပဵၼ် ၽၢင်ႁၢင်ႊ တၢင်းပဵၼ် spinocerebellar ataxia ၶွင်ၵူၼ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ (16, 47, 48) ၸွမ်းၼင်ႇၶၢဝ်ႇငၢဝ်းၸိူဝ်းၼၼ်ႉသေ၊ ပိူင်ၼူဢၼ်မူၼ်ႉမႄးဝႆႉၸိူဝ်ႉၽၼ်းဢၼ်မီး ၸိူဝ်ႉၽၼ်းဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႈသၼ်ႇထေႇၼၼ်ႉ ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်တၢင်း တၢင်းပဵၼ် spinocerebellar ataxia ၶွင်ၵူၼ်းလႄႈ မီးလွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ်ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈၶွင် mitochondrial (49, 50)၊ ဢၼ်ဝႆႉၼၵ်းၼႃၼိူဝ်လွင်ႈလမ်ႇလွင်ႈၶွင်လွင်ႈလဵပ်ႈႁဵၼ်း ၽွၼ်းယွၼ်ႈၶွင်လွင်ႈယူပ်ႈယွမ်း OXPHOS တီႈၼႂ်း PNPH ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ယွၼ်ႉၼၼ် မၼ်းထုၵ်ႇမႅၼ်ႈလီ တႃႇတေ ၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇ လႄႈ လဵပ်ႈႁဵၼ်း ႁူဝ်ၼပ်ႉ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ပိူၼ်ႈၼႆႉ ႁႂ်ႈမီးၽွၼ်းလီၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵူၺ်းၵႃႊ PNs ၼႆႉ မၼ်းႁူႉႁၼ်လႆႈ ႁႅင်းတဵၵ်း လႄႈ မၼ်းႁဵတ်းႁႂ်ႈ ႁူဝ်ၼပ်ႉ သႄးလ် ဢွၵ်းဢေႃ တင်းမူတ်း ဢေႇဝႆႉလႄႈ တႃႇၵၢၼ်လဵပ်ႈႁဵၼ်း ဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် omics တင်းၼမ်ၼၼ်ႉ လွင်ႈလိူၵ်ႈ ၽၢတ်ႇဢွၵ်ႇ သႄးလ် တင်းမူတ်းၼႆႉ မၼ်းတိုၵ်ႉပဵၼ် လွင်ႈၶဵင်ႇတႃႉ ဢၼ်ၼိူင်ႈယူႇ။ ပႅၵ်ႉသမ်ႉဝႃႈ မၼ်းဢမ်ႇၸမ်ပဵၼ်လႆႈ တႃႇတေလႆႈ လွင်ႈဢမ်ႇမီး လွင်ႈဢမ်ႇမူတ်းသႂ် တီႈသႄးလ် တၢင်ႇၸိူဝ်း (ပိူင်လူင်မၼ်း တိတ်ႉသျူး ၵူၼ်းလူင်) ၼၼ်ႉသေတႃႉ ႁဝ်းၶႃႈ ဢဝ် ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ ဢၼ်မီးၽွၼ်းလီ မႃးႁူမ်ႈၵၼ်တင်း FACS တႃႇတေလႆႈ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ၵုမ်ႇထူၼ်ႈ တႃႇထတ်းၸႅတ်ႈ ပရူဝ်ႇတိၼ်း လႄႈ မီးပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ႁူမ်ႇငမ်းလႆႈ ၼမ်ၼႃႇ (မွၵ်ႈ 3000 the cerebel data) (51)။ လူၺ်ႈလွင်ႈထိင်းသိမ်း လွင်ႈယူႇသဝ်းလႆႈ ၶွင်သႄးလ်တင်းမူတ်းၼၼ်ႉသေ လွၵ်းလၢႆးဢၼ်ႁဝ်းၶႃႈ ပၼ်ဝႆႉတီႈၼႆႈၼႆႉ ပၼ်ၶႂၢင်ႉႁႂ်ႈႁဝ်းၶႃႈ ထတ်းတူၺ်းလႆႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ၼႂ်းသဵၼ်ႈတၢင်း ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼႂ်း mitochondria ၼၼ်ႉၵွၺ်းဢမ်ႇၵႃး တႃႇထတ်းတူၺ်းပႃး လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ၼႂ်းၶူၼ်းလေႃး cytoplasmic မၼ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ (52၊ 53)။ လွၵ်းလၢႆးဢၼ်ႁဝ်းၶႃႈ လၢတ်ႈၼႄၼႆႉ မၼ်းၵဵဝ်ႇၵပ်းလူၺ်ႈ လွင်ႈလဵပ်ႈႁဵၼ်း သႄးလ် Purkinje ၵူၺ်းဢမ်ႇၵႃး မၼ်းၸၢင်ႊၸႂ်ႉတိုဝ်းလႆႈ ငၢႆႈငၢႆႈလူမ်လူမ် တီႈသႄးလ် မဵဝ်းလႂ်သေဢမ်ႇဝႃႈ တႃႇတေၵႄႈလိတ်ႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ၼႂ်းဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီးတၢင်းပဵၼ် ဢိၵ်ႇပႃး ပိူင်တၢင်ႇဢၼ် ဢၼ်ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈ ၶွင် mitochondrial ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
လိုၼ်းသုတ်းမႃး ႁဝ်းၶႃႈလႆႈႁူႉႁၼ် ၽၵ်းတူယူတ်းယႃ ၽွင်းယၢမ်း ၵၢၼ်ၶိုၼ်းၶပ်ႉၶိုင် ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ထၢတ်ႈ ဢၼ်တေၸၢင်ႊ ၶိုၼ်းမႄး လွင်ႈၼႄ လွင်ႈၶီၸႂ် သႄးလ် (cell) ၼၼ်ႉ တဵမ်ထူၼ်ႈသေ ႁႄႉၵင်ႈလႆႈ လွင်ႈဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ လူႉလႅဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ယွၼ်ႉၼၼ် လွင်ႈပွင်ႇၸႂ်ၼိူဝ် လွင်ႈႁဵတ်းသၢင်ႈ ဢၼ်မီးလွင်ႈတုမ်ႉယွၼ်ႈၼိူဝ် လွင်ႈၶိုၼ်းသၢႆၾႆး ဢၼ်လႆႈသပ်းလႅင်းၼႄဝႆႉတီႈၼႆႈၼႆႉ တေၸၢင်ႈပၼ်လႆႈ ပိုၼ်ႉထၢၼ်ႈတၢင်းႁူႉ ၼိူဝ်လွင်ႈယူတ်းယႃဢၼ်ၸၢင်ႈပဵၼ်လႆႈ တွၼ်ႈတႃႇ ထိင်းသိမ်းလွင်ႈႁဵတ်းသၢင်ႈၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၽွင်းမိူဝ်ႈ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ်ဢမ်ႇတဵမ်ထူၼ်ႈၶွင် mitochondrial ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵၢၼ်ၶူၼ်ႉၶႂႃႉမိူဝ်းၼႃႈ ဢၼ်ယိူင်းဢၢၼ်းတႃႇတေ ၸႅၵ်ႇၽႄ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ လွင်ႈထၢတ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ဢဵၼ်ႁႅင်း ၼႂ်းသႄးလ် ဢွၵ်းဢေႃတၢင်ႇဢၼ်ၼၼ်ႉ လူဝ်ႇလႆႈ ပိုတ်ႇၼႄ လွင်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း လွၵ်းပိူင်ဢၼ်ၼႆႉ တီႈတၢင်းပဵၼ် ဢဵၼ်တၢင်ႇဢၼ် ႁႂ်ႈတဵမ်ထူၼ်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ၼူ MitoPark ၼႆႉ လႆႈလၢတ်ႈၼႄမႃး မိူဝ်ႈဢွၼ်တၢင်း (31) ။ ၼူ C57BL/6N ဢၼ်မီး ၸိူဝ်ႉၽၼ်း Mfn2 ဢၼ်မီးႁိမ်းႁွမ်း loxP ၼၼ်ႉ လႆႈလၢတ်ႈၼႄဝႆႉ မိူဝ်ႈဢွၼ်တၢင်း (18) သေ လႆႈၶၢမ်ႈၵၼ်တင်း ၼူ L7-Cre (23) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လုၵ်ႈလၢင်းဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ၵၼ်သွင်ဢၼ်ဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇၶၢမ်ႈၵၼ်တၢင်း ၼူဢၼ်မိူၼ်ၵၼ် Mfn2loxP/Mfn2loxP တွၼ်ႈတႃႇတေႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ၸိူဝ်ႉၽၼ်းဢၼ်တႅတ်ႈၼႅတ်ႈၶွင် Purkinje တွၼ်ႈတႃႇ Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈၼ်ႂးၸုမ်းၽႄၶွင်လွင်ႈၵူပ်ႉၵူႊၼၼ်ႉ၊ ဢႄးလီႇလီႇ Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (ၵိုတ်း-mtYFP) ၼၼ်ႉလႆႈၵပ်းသိုပ်ႇၵၼ်လူၺ်ႈလွင်ႈၶၢမ်ႈၵၼ်ဢၼ်ၽိူမ်ႉသႂ်ႇထႅင်ႈ(20) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လၢႆးႁဵတ်းသၢင်ႈ တူဝ်သတ်းတင်းမူတ်းၼႆႉ လႆႈႁဵတ်းၸွမ်းၼင်ႇ ၶေႃႈၸီႉသင်ႇ မိူင်းယူးရူပ်ႉ၊ ၸိူဝ်ႉၸၢတ်ႈ လႄႈ ၸုမ်းၸိူဝ်းၼႆႉသေ လႆႈၶႂၢင်ႉတီႈ LandesamtfürNatur ၶွင် Umwelt လႄႈ Verbraucherschutz မိူင်းရၢႆးပွတ်းႁွင်ႇ-ဝႅတ်ႉၾႃႇလီႇယႃႇ မိူင်းၵျႃႇမၼီႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵၢၼ်တူဝ်သတ်းၼႆႉၵေႃႈ ၸွမ်းၼင်ႇ ၸုမ်းပၢႆးသၢႆႊတူဝ်သတ်း ၼႂ်းႁွင်ႈၽႃႇတတ်း မိူင်းယူးရူပ်ႉၶဝ် ၸီႉၼႄဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ဝၢႆးသေ ဢဝ်ယႃႈယႃ ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ႁူးၵူင် ၼၢင်းယိင်းပႃးတွင်ႉ ဢမ်ႇႁူႉတူဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ ဢဝ်လုၵ်ႈဢွၼ်ႇၼူၼၼ်ႉ ဢွၵ်ႇႁင်းၶေႃ (E13) ၼႆယဝ်ႉ။ ၵွၼ်ႈသီၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် ၼမ်ႉယၢင်ၵိူဝ် ဢၼ်ၽဵင်ႇပဵင်းၵၼ် ၶွင် Hanks (HBSS) ဢၼ်ဢဝ် Hepes 10 mM မႃးၽိူမ်ႉထႅမ်ဝႆႉၼၼ်ႉသေ ဢဝ်ၵႂႃႇပၼ် ၼႂ်းၼမ်ႉယၢင် ဢၼ်မူၼ်ႉမႄးဝႆႉ ၶွင် Dulbecco ဢၼ်ပႃး ပႃႇပႅၼ်ႇ (20 U/ml) လႄႈ သီႇသတီးၼိၼ်ႇ (1μg/ml) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢဝ် တိတ်ႉသျူး ၼႂ်း DMEM ၼၼ်ႉ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈ) သေ ဢဝ်လၢႆး ႁုင်တူမ်ႈ ဢႅၼ်ႇၸႆးမီႇ ၼၼ်ႉ ၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇ။ Ml) တီႈ 37°C တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 20 မိၼိတ်ႉသေ ဢဝ်ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈသေ ၶူၼ်းသႂ်ႇၼႂ်း DMEM ဢၼ်ဢဝ် ၼမ်ႉယႃႈယႃ ဝူဝ်းၼႂ်းတွင်ႉ 10% မႃးၽိူမ်ႉထႅမ်ပၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ သႄးလ်ၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉၼိူဝ် ၽႅၼ်ႇႁူမ်ႇမၢၼ်ႇ ဢၼ်ဢဝ် polylysine ႁူမ်ႇဝႆႉ တီႈတၢင်းၼႅၼ်ႈၼႃ 2×106 ၼႂ်းၽိူၼ်ၽိင်ႈငႄႈ 6 cm ဢမ်ႇၼၼ် တီႈတၢင်းၼႅၼ်ႈၼႃ 0.5×105 သႄးလ်/cm2 တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈထတ်းသၢင်ၶႅပ်းႁၢင်ႈ။ ဝၢႆးသေ 4 ၸူဝ်ႈမူင်းယဝ်ႉ ဢဝ်ၼမ်ႉယႃႈယႃ ဢၼ်ဢမ်ႇပႃး သီႇရမ်ႇ Neurobasal ဢၼ်ပႃး ထၢတ်ႈ B27 1% လႄႈ GlutaMax 0.5 mM ၼၼ်ႉ မႃးတႅၼ်းတၢင်။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈထိင်းဝႆႉတီႈ 37°C လႄႈ 5% CO2 ၼႂ်းၶၢဝ်းတၢင်းလွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်းၼၼ်ႉသေယဝ်ႉ လဵင်ႉပၼ်ၼိုင်ႈဝူင်ႈၼိုင်ႈပွၵ်ႈယဝ်ႉ။ တႃႇတေႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈၶိုၼ်းႁူမ်ႈၵၼ် ၼႂ်းတူဝ်ထူပ်းၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း 3μl (ၽိူၼ်ၽိင်ႈငႄႈ 24 ႁူး) ဢမ်ႇၼၼ် 0.5μl (ၶႅပ်း 24 ႁူး) ၶွင် မႅင်းဝၢႆးရၢတ်ႉသ် AAV9 ဢၼ်ပႃႈတႂ်ႈၼႆႉ တႃႇယူတ်းယႃ ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၼႂ်းဝၼ်းတီႈသွင် ၼႂ်းတူဝ်ထူပ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ: AAV9.CMV.PI.eGFP ၼႆယဝ်ႉ။ WPRE.bGH (ဢႅတ်ႉၵျိၼ်ႇ၊ မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ 105530-AAV9) လႄႈ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (ဢႅတ်ႉၵျိၼ်ႇ၊ မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ 105545-AAV9) ၸိူဝ်းၼႆႉယဝ်ႉ။
ၼူ Mfn1 လႄႈ Mfn2 ဢၼ်တဵမ်ထူၼ်ႈ DNA (ဢၼ်လႆႈမႃးတီႈ ပလႅတ်ႉသမိတ်ႉ Addgene #23212 လႄႈ #23213 ၵူႈဢၼ်ဢၼ်) ၼၼ်ႉ လႆႈမၢႆဝႆႉၸွမ်း ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ V5 (GKPIPNPLLGLDST) တီႈ C-terminus သေ လႆႈထုၵ်ႇႁူမ်ႈလေႃးၵၼ်တၢင်း mCherry ၼ်ႂးၶွပ်ႇ ဢၼ်လတ်းၽၢၼ်ႇ ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ T2A ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ Grx1-roGFP2 ၼႆႉ ပဵၼ်ၶွင်တွၼ်ႈ ဢၼ် ႁၢႆႇတႄႇလ်ပၢၵ်ႉ TP တီႇၵျိတ်ႉ DFKZ (တွၵ်ႇတႃႇ ၶရႅပ်ႉၾူတ်ႉၾူတ်ႉသႅၼ်ႇထရမ်ႇ) ပၼ်မႃးၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လူၺ်ႈလွင်ႈဢဝ်လွၵ်းလၢႆးႁဵတ်းငၢႆးၵၼ် ဢၼ်ယၢမ်ႈႁဵတ်းမႃးၼၼ်ႉ မႃးတႅၼ်းတၢင် ၶႅပ်းထႆႇ tdTomato ၼၼ်ႉသေ ၶႅပ်းထႆႇၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇႁဵတ်းငၢႆးၵၼ် တီႈၼႂ်းလုပ်ႇသၼ်လင် pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၽလႅၵ်ႉသ်-mၶျႄႇရီႇ-T2A-MFN1-V5 လႄႈ pAAV-CAG-ၾလႅၵ်ႉသ်-Grx-roGFP2 ဢၼ်ပဵၼ် ဝႅၵ်ႉတႃႇ ၸိူဝ်းၼႆႉယဝ်ႉ။ လွၵ်းလၢႆးဢၼ်မိူၼ်ၵၼ်ၼႆႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်းမႃး တႃႇႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ၶိူင်ႈၵုမ်းထိင်း pAAV-CAG-FLEX-mCherry ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တႃႇတေႁဵတ်းဢွၵ်ႇလႆႈ လွင်ႈၵေႃႇသၢင်ႈ AAV-shPCx ၼၼ်ႉ လူဝ်ႇလႆႈမီး ပလႅတ်ႉသမိတ်ႉ AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ဢၼ်ပႃး ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ DNA ဢၼ်ႁဵတ်းပဵၼ် ၵူၵ်ႉ တႃႇ shRNA ဢၼ်ယိူင်းဢၢၼ်းဝႆႉ ၼူ PCx (5′CTAGCTGTGTGTGACTAACTA 3′) ၽၢႆႇတႂ်ႈ လွင်ႈၵုမ်းထိင်း ၶိူင်ႈၸွႆႈထႅမ် U6 ၼၼ်ႉ mCherry ၼႆႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၽၢႆႇတႂ်ႈ လွင်ႈၵုမ်းထိင်း ၶိူင်ႈၸွႆႈထႅမ် CMV ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵၢၼ်ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ၶိူင်ႈၸွႆႈထႅမ် AAV vectors ၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းၸွမ်းၼင်ႇ ၶေႃႈသင်ႇ ၽူႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ (Cell Biolabs) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼႂ်းၵႅပ်ႈမၼ်း ၸႂ်ႉတိုဝ်း ပလႅတ်ႉသမိတ်ႉ ဢၼ်တေႃႉသူင်ႇ mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5)၊ (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ဢမ်ႇၼၼ် Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ဢၼ်ပဵၼ်မၢႆလပ်ႉ ၸိူဝ်ႉၽၼ်း၊ ဢိၵ်ႇပႃး မၢႆလပ်ႉ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ၶႅပ်ႇသိတ်ႉ AAV1 လႄႈ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ၵမ်ႉထႅမ် လွင်ႈႁေႃႇပလႅတ်ႉသမိတ်ႉ ပလႅတ်ႉသမိတ်ႉ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း လွၵ်းလၢႆး ၶႄႇလ်သီႇယမ်ႇၽွတ်ႉသၽဵတ်ႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ မႅင်းဝၢႆးရၢတ်ႉသ် ဢၼ်ဢမ်ႇပႆႇလႆႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇၼၼ်ႉ လႆႈမႃးလူၺ်ႈ လွင်ႈပၼ်ႇၶွပ်ႈ ၶႅင်-ၶႅင် ၼႂ်းဢၢပ်ႇၼမ်ႉၶႅင်/ဢီႇတၼေႃး ဢၼ်ႁႅင်ႈ လႄႈ သႄးလ် ဢၼ်ယႃႉပႅတ်ႈ ၼႂ်းၼမ်ႉၵိူဝ် ဢၼ်မီးထၢတ်ႈ phosphate buffered (PBS) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶိူင်ႈတေႃႉသူင်ႇ AAV ၼႆႉ လႆႈထုၵ်ႇႁဵတ်းႁႂ်ႈမူတ်းသႂ်လူၺ်ႈ လွင်ႈထၢတ်ႈ iodixanol ဢၼ်ဢမ်ႇသိုပ်ႇၵၼ် (24 ၸူဝ်ႈမူင်း တီႈ 32,000 rpm လႄႈ 4°C) သေယဝ်ႉ ဢဝ်ၶိူင်ႈထၢတ်ႈ Amicon ultra-15 သေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈမၼ်းၸုတုမ်ၵၼ်ဝႆႉယဝ်ႉ။ ၸီႇၼိူမ်း ဢၼ်မိူၼ်ၵၼ်တင်း ၸီႇၼိူမ်း (GC)/ml 2.9×1013 ၼၼ်ႉ၊ (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) လႄႈ AAV1-CAG-Flex-Grx-roGFP2 (8.9×1012 ၵျီႇ/မီႇလီႇ) ၼႆယဝ်ႉ။
ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ပဵၼ်ငဝ်ႈငႃႇၼၼ်ႉ လႆႈၶူတ်းဢွၵ်ႇ ၼႂ်းၼမ်ႉၶႅင် 1x PBS သေ ႁဵတ်းပဵၼ် မၢၵ်ႇသေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ် ဢၼ်လဵဝ်ၵၼ် ၼႂ်း 0.5% Triton X-100 / 0.5% သူဝ်ႇတီႇယမ်ႇ တီႇဢွၵ်ႇသီႇၶူဝ်ႇလႅတ်ႉ/PBS lysis buffer ဢၼ်ပႃး ၽွတ်ႉသတႅတ်ႉ လႄႈ ပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ (Roche) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ ထၢတ်ႈထႅင်ႈႁႅင်းၼိူဝ်ႉၼႆႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း လွင်ႈထတ်းသၢင် ဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ပၢႆႇသီႇၼိၼ်ႇၼိၵ်ႉ (Thermo Fisher Scientific) သေ ႁဵတ်းသၢင်ႈမႃးယဝ်ႉ။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ထၢတ်ႈထႅင်ႈႁႅင်းၼိူဝ်ႉၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇဢဝ် SDS-polyacrylamide ၸေႊလ် ဢီႇလႅတ်ႇထရူဝ်ႇၾူဝ်ႇရီႇသ်သေ ၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇသေယဝ်ႉ ဢဝ်မႃးယွမ်ႉသီၼိူဝ် ၽီႉ polyvinylidene fluoride (GE Healthcare) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ႁႄႉႁၢမ်ႈ တီႈဢၼ်ဢမ်ႇတႅတ်ႈၼႅတ်ႈသေ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈၸွမ်း ၶူဝ်ႈၶွင်ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈတၢင်းပဵၼ် ဢၼ်ပဵၼ်ငဝ်ႈမၼ်း (တူၺ်းတီႈ လွၵ်း S1 တႃႇႁူဝ်ယွႆႈမၼ်း) ၼႂ်းၼမ်ႉၼူမ်း 5% ၼႂ်း TBST (Tris-buffered saline ဢၼ်ပႃး Tween)၊ ဢဝ်ၶူဝ်ႈၶွင်ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈတၢင်းပဵၼ် ဢၼ်ပဵၼ်ပိုၼ်ႉထၢၼ်ၼၼ်ႉ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ ၶိုၼ်းၼိုင်ႈ တီႈ +4°C ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးသေ သုၵ်ႈသီယဝ်ႉ ဢဝ်ၶိူင်ႈႁႄႉၵင်ႈ တၢင်းပဵၼ် ထူၼ်ႈသွင် ၼၼ်ႉ သႂ်ႇပၼ် တီႈမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈ 2 ၸူဝ်ႈမူင်း။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ လူၺ်ႈလွင်ႈၽုၵ်ႇသွမ်ႈ တီႈဢၼ်မိူၼ်ၵၼ်ၼၼ်ႉ တင်း ၶူဝ်းၶွင်ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈတၢင်းပဵၼ် anti-β-actin ၼၼ်ႉသေ လႆႈမၵ်းမၼ်ႈဝႃႈ လွင်ႈတၢင်ႇၼိူဝ်မၼ်းမိူၼ်ၵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈႁႃႁၼ် လူၺ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈပဵၼ် ၶေးမီးလႅင်း လႄႈ ႁဵတ်းႁႂ်ႈၶေးမီးလႅင်း ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ (GE Healthcare)။
ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်မိူဝ်ႈဢွၼ်တၢင်း ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ ၼိူဝ် ၽႅၼ်ႇႁူမ်ႇမၢၼ်ႇၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS သေ မၼ်ႈၵိုမ်းဝႆႉ တီႈၶၢဝ်းယၢမ်း ဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ တီႈတၢင်းမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 10 မိၼိတ်ႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၽိုၼ်လိၵ်ႈဢၼ်ႁူမ်ႇဝႆႉၼၼ်ႉ ဢွၼ်တၢင်းသုတ်း ဢဝ် Triton X-100/PBS 0.1% သေ ၸိုမ်းၶဝ်ႈၵႂႃႇ တီႈတၢင်းမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 5 မိၼိတ်ႉသေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ဢဝ်သႂ်ႇၼႂ်း ၼမ်ႉယႃႈယႃ ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ [3% ဢႄးလ်ပူးမိၼ်ႇ သီႇရမ်ႇဝူဝ်း (BSA)/PBS] ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၼ်းတီႈသွင်ၼၼ်ႉ ဢဝ်ၽႃႈႁူမ်ႇ ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈဝႆႉၼၼ်ႉ သုၵ်ႈသီပၼ်သေ ဢဝ်ၽႃႈႁူမ်ႇ ဢၼ်ထုၵ်ႇမႅၼ်ႈ ဢၼ်ႁူမ်ႈၵၼ်ဝႆႉ တင်း ၽူဝ်ႇရူဝ်ႇၾူဝ်ႇ ၼၼ်ႉ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ တီႈတၢင်းမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈ 2 ၸူဝ်ႈမူင်း၊ လိုၼ်းသုတ်း ဢဝ်တူဝ်ယၢင်ႇၸိူဝ်းၼၼ်ႉ သုၵ်ႈသီပၼ် ၼႂ်း PBS လီလီသေ ဢဝ် 4′,6-တၢႆႇဢႃႇမီႇတီႇၼူဝ်ႇ-2 -ၽႅၼ်ႇၼီႇလီႇၼူဝ်ႇ (DAPI) ၼၼ်ႉ ဢဝ်သီၶိုၼ်းသေ ဢဝ် Aqua-Poly/Mount သေ မၼ်ႈဝႆႉၼိူဝ် ၽိုၼ်လိၵ်ႈ မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ၼူ (တူဝ်ပေႃႈလႄႈ တူဝ်မႄႈ) ၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ်ယႃႈယႃ ၶႄႇတႃႇမိၼ်ႇ (130 mg/kg) လႄႈ ၸၢႆႇလႃႇၸိၼ်ႇ (10 mg/kg) သမ်းသႂ်ႇၼႂ်းတွင်ႉသေ ဢဝ်ယႃႈယႃ ၶႃႇပရူဝ်ႇၾိၼ်ႇ (5 mg/kg) သေ သမ်းပၼ် တႂ်ႈၼိူဝ်ႉ , ယဝ်ႉၵေႃႈ ဢဝ်သႂ်ႇၼႂ်းၶိူင်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢမ်ႇႁူႉတူဝ် (Kopd a pamf) equi. ဢဝ်ၵွၵ်းႁူဝ်ဢွၵ်ႇသေ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈၶုတ်းၶဵဝ်ႈသေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ပွတ်းတွၼ်ႈ ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်တင်း လုပ်ႇ mis ၼၼ်ႉ ဢူၼ်ႈဢွၼ်ႇ (လုၵ်ႉတီႈ lambda : ႁၢင်ႊ 1.8, ၽၢႆႇၼႃႈ 1, ဢၼ်ၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်တင်း lobules IV လႄႈ V) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉၶဵမ်သွၵ်းတႃ ဢၼ်ၵူင်ႇသေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ႁူးၵွၵ်းႁူဝ်ဢွၼ်ႇ လီလီ ၼင်ႇႁိုဝ် တေဢမ်ႇၵူၼ်ႇပင်း သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ ဢၼ်မီးတႂ်ႈၼၼ်ႉ။ ယဝ်ႉၵေႃႈ ဢဝ်သဵၼ်ႈလိူတ်ႈၵႅဝ်ႈ ဢၼ်ၸၼ်ဝႆႉ ဢၼ်မၢင်ၼၼ်ႉ သႂ်ႇၼႂ်းႁူးဢွၼ်ႇၼၼ်ႉလွႆးလွႆး (တႄႇတီႈ -1.3 တေႃႇထိုင် -1 တီႈၽၢႆႇၼႂ်းတွင်ႉ ၶွင် dura mater) သေ ဢဝ် AAV 200 တေႃႇထိုင် 300 nl သမ်းသႂ်ႇၼႂ်း ၶိူင်ႈသႂ်ႇသၢႆၼမ်ႉဢွၼ်ႇ (Narishige) လူၺ်ႈ သဵၼ်ႈသၢႆမိုဝ်း (Narishige tisure) ၶၢဝ်းယၢမ်း ႁႅင်းတဵၵ်း 2000 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ မိၼိတ်ႉ ၽၵ်းတူ။ ဝၢႆးသေ သႂ်ႇယႃႈယႃယဝ်ႉ ဢဝ်သၢႆၼမ်ႉယႃႈယႃ သႂ်ႇထႅင်ႈ 10 မိၼိတ်ႉ ႁႂ်ႈၸိူဝ်ႉမႅင်း ၽႄႈၸပ်းၵၼ် တဵမ်ထူၼ်ႈ။ ဝၢႆးသေ ဢဝ်သဵၼ်ႈလိူတ်ႈဢွၼ်ႇ ဢွၵ်ႇမႃးယဝ်ႉ တေလႆႈယဵပ်ႉပၼ် ၽိဝ်ၼင် ႁႂ်ႈႁွႆးၸဵပ်း ဢေႇလူင်းသေ ႁႂ်ႈတူဝ်သတ်း ၸိုၼ်ႈသႂ်ၶိုၼ်း။ ဝၢႆးသေ ၽႃႇတတ်းယဝ်ႉ လႆႈဢဝ်ယႃႈယႃ ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢမ်ႇၸဵပ်းသႅပ်ႇ (caspofen) သေ ယူတ်းယႃပၼ် တူဝ်သတ်းၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ၶၢဝ်းတၢင်းလၢႆဝၼ်းသေ ၼႂ်းၶၢဝ်းယၢမ်းၼၼ်ႉ လႆႈပႂ်ႉတူၺ်း ငဝ်းလၢႆးတူဝ်ၶိင်းၶဝ် လီလီသေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ်တၢႆ ၸွမ်းၶၢဝ်းယၢမ်း ဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လၢႆးႁဵတ်းလၢႆးသၢင်ႈတင်းမူတ်း လႆႈႁဵတ်းၸွမ်းၼင်ႇ ၶေႃႈၸီႉသင်ႇ မိူင်းယူးရူပ်ႉ၊
ဢဝ်ယႃႈယႃ ၶေႇတႃႇမိၼ်ႇ (100 mg/kg) လႄႈ ၸၢႆႇလႃႇၸိၼ်ႇ (10 mg/kg) သေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ တူဝ်သတ်းၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ဢမ်ႇႁူႉတူဝ်သေ ဢဝ် PBS 0.1 M သႂ်ႇၼႂ်းႁူဝ်ၸႂ် ဢွၼ်တၢင်းသုတ်းသေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ဢဝ် PFA 4% ၼႂ်း PBS ၼၼ်ႉ သႂ်ႇၼႂ်းႁူဝ်ၸႂ်။ ဢဝ်တိတ်ႉသျူးၼၼ်ႉ ၽႃႇတတ်းသေ ဢဝ်ဝႆႉၼႂ်း 4% PFA/PBS ၶိုၼ်းၼိုင်ႈ တီႈ 4°C ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈသၼ်ႇဝႆ (Leica Microsystems GmbH၊ ဝဵင်းဝီႇယႅၼ်ႇၼႃႇ၊ မိူင်းဢေႃးသထရီးယႃး) သေ ႁၢင်ႈႁႅၼ်း တွၼ်ႈဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ၼႃ 50 μm ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မၼ်ႈၵိုမ်း ၼႂ်း PBS ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ သင်ဝႃႈ ဢမ်ႇလႆႈမၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ တၢင်ႇလွင်ႈၼႆၸိုင် လွင်ႈယွမ်ႉသီ တွၼ်ႈဢၼ်လႆလွတ်ႈလႅဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းၸွမ်းၼင်ႇ ဢၼ်လၢတ်ႈၼႄဝႆႉ ၽၢႆႇၼိူဝ် (13) ၼၼ်ႉ တီႈတၢင်းမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈသေ ၶူၼ်းၶဝ်းလေႃးၵၼ်။ ပေႃးလၢတ်ႈၵႂၢင်ႈၵႂၢင်ႈၶႂၢင်ၶႂၢင်ၸိုင် ဢွၼ်တၢင်းသုတ်း ဢဝ်ၽွင်ဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ ဢဝ် Triton X-100/PBS 0.5% သေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈမၼ်းၸိုမ်းၶဝ်ႈလႆႈ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 15 မိၼိတ်ႉ တီႈတၢင်းမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈ၊ တွၼ်ႈတႃႇ ဢႅပ်ႇတူဝ်ႇမၢင်ဢၼ် (Pcx လႄႈ Shmt2) ၼၼ်ႉ ဢဝ်ၼႂ်း tris-EDTA buffer တီႈ 80°C (PH 9) ၼၼ်ႉ ဢဝ်မႆႈပၼ် ၽၵ်းယိူဝ်ႈၼၢင်းၶဵဝ် တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 25 မိၼိတ်ႉ တႅၼ်းတီႈ ၶၵ်ႉတွၼ်ႈဢၼ်ၼႆႉ။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ တွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် ၶူဝ်းၶွင်ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈတၢင်းပဵၼ် ဢၼ်ပဵၼ်ငဝ်ႈငႃႇ (တူၺ်းတီႈ လွၵ်း S1) ၼၼ်ႉ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ ၼႂ်းၶိူင်ႈႁႄႉၵင်ႈ (3% BSA/PBS) တီႈ 4°C ၶိုၼ်းၼိုင်ႈ လူၺ်ႈလွင်ႈၶူၼ်းၶဝ်း။ ထိုင်မႃးထႅင်ႈဝၼ်းၼိုင်ႈ ဢဝ်ၶိူင်ႈႁႄႉၵင်ႈ ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ တၢင်းပဵၼ်ၼၼ်ႉ သုၵ်ႈသီပၼ် တွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉသေ ဢဝ်ၶိူင်ႈႁႄႉၵင်ႈ ဢၼ်ထုၵ်ႇမႅၼ်ႈ ဢၼ်ႁူမ်ႈၵၼ်ဝႆႉ တင်း fluorophore ၼၼ်ႉ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ တီႈတၢင်းမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈ 2 ၸူဝ်ႈမူင်း၊ လိုၼ်းသုတ်း ဢဝ်တွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ သုၵ်ႈသီပၼ် ၼႂ်း PBS လီလီသေ ဢဝ် DAPI သေ ဢဝ် AquaPolymount မႃးမၼ်ႈၵိုမ်းဝႆႉ တီႈၼိူဝ် ၽႅၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ဢဝ်မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း လႅတ်ႇသိူဝ်ႇ (TCS SP8-X ဢမ်ႇၼၼ် TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ဢၼ်ပႃး လႅတ်ႇသိူဝ်ႇသၢႆလႅင်းသီၶဵဝ် လႄႈ လႅတ်ႇသိူဝ်ႇ ဢၼ်မီးသၢႆလႅင်း 405 diode ၼၼ်ႉ မႃးထတ်းတူၺ်း တူဝ်ယၢင်ႇမၼ်းယဝ်ႉ။ လူၺ်ႈလွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ fluorophore ၸႂ်တိုၼ်ႇတဵၼ်ႈလႄႈ ၵဵပ်းႁွမ်သၢႆငၢႆ လူၺ်ႈ Hybrid Detector (HyDs) ၼၼ်ႉသေ ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ LAS-X ၼႆႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်းမႃး တႃႇၵဵပ်းႁွမ် ၶႅပ်းႁၢင်ႈဢၼ်သႂ်ႇၵၼ်ဝႆႉ ဢၼ်မႅၼ်ႈၸွမ်း တူဝ်ယင်ႇ Nyquist ၼႂ်းပိူင်ဢၼ်ၸႅၼ်ႇဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လၢႆး BrightR)။ တႃႇတေလူတ်းယွမ်း ၽၢႆႇလင်ၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း Gating 0.3 တေႃႇထိုင် 6 ns ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
လွင်ႈထႆႇႁၢင်ႈ ၶၢဝ်းယၢမ်းတႄႉတႄႉ ၶွင်သႄးလ် ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဝႆႉ။ ဝၢႆးသေ ၸႅၵ်ႇၽႄ ၼႂ်းၵၢင် Neurobasal-A ဢၼ်ပႃး ထၢတ်ႈ B27 1% လႄႈ GlutaMax 0.5 mM ၼၼ်ႉယဝ်ႉ သႄးလ်ၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ ၼိူဝ် ၽႅၼ်ႇမၢၼ်ႇ ဢၼ်ဢဝ် poly-l-lysine သႂ်ႇဝႆႉၼၼ်ႉၵမ်းလဵဝ် (μ-Slide8 လီလီ၊ တႃႇတေတမ်းဝၢင်း။ လွင်ႈထႆႇႁၢင်ႈ ၶၢဝ်းယၢမ်းတႄႉတႄႉၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းၼိူဝ် မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း လႅတ်ႇသိူဝ်ႇ Leica SP8 ဢၼ်ပႃး လႅတ်ႇသိူဝ်ႇသီၶဵဝ် HyD၊
ၼူၼၼ်ႉ ဢဝ်ထၢတ်ႈၵႃႇပုၼ်ႇတၢႆႇဢွၵ်ႇသၢႆႉ သေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈမၼ်း ဢမ်ႇႁူႉတူဝ် ဝႆးဝႆးသေ ဢဝ်ႁူဝ်မၼ်း ဢွၵ်ႇပႅတ်ႈ တီႈၵွၵ်းႁူဝ်မၼ်း ဝႆးဝႆးသေ တႅပ်းႁႂ်ႈမၼ်း ၼႃ 200μm (တႃႇၸၢမ်းတူၺ်း လွင်ႈတၢင်ႇမၢႆ Fi3C) ဢမ်ႇၼၼ် ၼႃ 275μm (တႃႇလွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်း ၾူဝ်ႇတၼ်ႇသွင်ဢၼ်) ဢၼ်တဵမ်ဝႆႉ ၶူဝ်းၶွင် crece (VH-50) ဢၼ်မီးပႃႈတႂ်ႈၼႆႉ။ ပၢႆးသၢႆႊ ဝဵင်းဝႃႇလ်တၢပ်ႈ မိူင်းၵျႃႇမၼီႇ) ၼၼ်ႉ တဵမ်ဝႆႉ ထၢတ်ႈ ဢၼ်မႆႈမိူၼ်ၼမ်ႉၶႅင် 125 mM ဢၼ်မီးထၢတ်ႈၵႃႇပုၼ်ႇ (O2 95% လႄႈ CO2 5%) ဢၼ်မီး Ca2 ဢေႇ + ၼမ်ႉဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ႁဵတ်းဢဝ် (ACSF) NaCl ၊ ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇ 0.5 mM CaCl2 လႄႈ 3.5 mM MgCl2 (ႁႅင်းဢွၵ်းဢေႃ 310 တေႃႇ 330 mmol) ၸိူဝ်းၼႆႉယဝ်ႉ။ ဢဝ် ၽိုၼ်ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ သူင်ႇၵႂႃႇတီႈ ႁွင်ႈဢၼ်ပႆႇၽုၵ်ႇသွမ်ႈ ဢၼ်ပႃး Ca2 + ACSF ၼမ်လိူဝ် (NaCl 125.0 mM၊ KCl 2.5 mM၊ သွတ်ႉတီႇယမ်ႇၽွတ်ႉသႅတ်ႉ 1.25 mM၊ NaHCO3 25.0 mM၊ Ca2.0m d-glucose 25.0 mM၊ MgCl2) ၵၢင်) pH 7.4 လႄႈ 310 တေႃႇ 320 မီႇလီႇမီႇလီႇ)။
ၽွင်းမိူဝ်ႈႁဵတ်းၵၢၼ်ထႆႇႁၢင်ႈၼၼ်ႉ ၶႅပ်းႁၢင်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈၶၢႆႉၵႂႃႇတီႈ ႁွင်ႈထႆႇႁၢင်ႈဢၼ်ႁၢင်ႈႁႅၼ်းဝႆႉၼၼ်ႉသေ လွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်းၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းဝႆႉ ၽၢႆႇတႂ်ႈ လွင်ႈထႆႇႁၢင်ႈ ACSF ဢၼ်ဢမ်ႇထၢတ်ႇဢမ်ႇဝၢႆး တီႈတၢင်းမႆႈဢၼ်ဢမ်ႇလႅၵ်ႈလၢႆႈ 32° တေႃႇထိုင် 33°C ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်ထတ်းတူၺ်း ထၢတ်ႈလေႇသိူဝ်ႇ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း သၢႆလႅင်းလႅတ်ႇသိူဝ်ႇ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ဢၼ်ပႃး မၢၼ်ႇၽီလူး Leica 25x (NA 0.95, ၼမ်ႉ)၊ မွၵ်ႇၵွၼ် FLIM (ပိၵူဝ်ႇႁႃး300၊ ပိၵူဝ်ႇၶွၼ်ႇ)။
FLIM ၶွင် Grx1-roGFP2 ။ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ ၼႂ်းသၢႆငၢႆ PNs ၼႆႉ လႆႈတႅၵ်ႈၸွမ်း သွင်ၽူဝ်ႇတၼ်ႇ FLIM ၼႂ်းဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီးသၢႆလႅင်း တီႈဢၼ် ၶိူင်ႈၸွပ်ႇ တူဝ်မီးၸႂ် Grx1-roGFP2 ယိူင်းၸူး PNs ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼႂ်းထၢပ်ႈ PN ၼၼ်ႉ ၼႃႈတီႈဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ လႆႈလိူၵ်ႈဝႆႉ မွၵ်ႈ 50 တေႃႇ 80 μm တႂ်ႈၽိဝ်ၼႃႈ ၽိုၼ်ၼၼ်ႉ တႃႇႁႂ်ႈမၼ်ႈၸႂ်ဝႃႈ မီး PN ဢၼ်ႁဵတ်းလႆႈ (ဢၼ်ဝႃႈၼၼ်ႉ ဢမ်ႇမီး လွင်ႈၵေႃႇသၢင်ႈ မၢၵ်ႇႁိၼ် ဢမ်ႇၼၼ် လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ပိူင်ၾၢင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ၸွမ်း dendrites) လႄႈ ၶိူင်ႈၸွပ်ႇ roGFP2 ဢၼ်ပဵၼ်ၽွၼ်းလီသွင်ဢၼ် လႄႈ AAVxexe encoding sh mၶျႄႇရီႇ)။ ၵဵပ်းႁွမ်ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်ပဵၼ်ထႅဝ်လဵဝ် ဢၼ်မီး 2x digital zoom [တၢင်းယၢဝ်းႁွၼ် ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၸႂ်လမ်: 890 nm၊ 512 nm 512 ၽိၵ်ႉသိူဝ်ႇ]။ လွင်ႈသွၵ်ႈႁႃ - HyD ၽၢႆႇၼႂ်း၊ ၸုမ်းၽိူမ်ႉထႅမ် ၾူဝ်ႇရူဝ်ႇသျိၼ်ႇ ဢၢႆႇသူဝ်ႇထီႇဢူဝ်ႇသၢႆႇၼႅတ်ႉ (FITC)] လႄႈ လွင်ႈထတ်းႁၼ်ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ၽတ်ႉၽဵင်ႇ ၼႂ်းၶၢဝ်းတၢင်း 2 တေႃႇ 3 မိၼိတ်ႉ ၸိူဝ်းၼႆႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း တႃႇႁႂ်ႈ မၼ်ႈၸႂ်ဝႃႈ ၾူဝ်ႇတၼ်ႇ လႆႈၵဵပ်းႁွမ်ဝႆႉ ႁႂ်ႈတဵမ်ထူၼ်ႈ (ႁူမ်ႈၵၼ် 1000 ၾူဝ်ႇတၼ်ႇ) တႃႇတေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၶွပ်ႇမၼ်း ၵိုင်ႇငၢမ်ႇၵၼ်။ လွင်ႈႁူႉႁၼ်ၶွင် ၶိူင်ႈၸွပ်ႇ Grx1-roGFP2 လႄႈ လွင်ႈထတ်းသၢင် ငဝ်းလၢႆး FLIM ၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းၸွမ်း လွင်ႈပႂ်ႉတူၺ်း ၵႃႊၶၼ် ဢသၢၵ်ႈ roGFP2 မိူဝ်ႈဢဝ် exogenous 10 mM H2O2 သႂ်ႇၼႂ်း ACSF ဢၼ်ၸိုမ်းၶဝ်ႈ (တႃႇႁႂ်ႈ လွင်ႈဢွၵ်ႇသီႇၵျိၼ်ႇ ၼမ်သုတ်း၊ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢသၢၵ်ႈ တိူဝ်းလိူဝ်မႃး) လႄႈ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ဢဝ် mremizitzo of the လူတ်းယွမ်း ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢသၢၵ်ႈ ယွမ်းလူင်း) (ႁၢင်ႈ S8, D တေႃႇထိုင် G)။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း FLIMfit 5.1.1 software သေ ထတ်းသၢင်တူၺ်း ၶေႃႈတွပ်ႇဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉသေ ႁႂ်ႈမႅၼ်ႈၸွမ်း လွင်ႈလူႉလႅဝ် ဢၼ်ပဵၼ် တူဝ်ထပ်ႈႁူဝ် ဢၼ်လဵဝ် ၶွင်ၶႅပ်းႁၢင်ႈတင်းမူတ်း ႁႂ်ႈမႅၼ်ႈၸွမ်း IRF ဢၼ်တႅၵ်ႈဝႆႉ (လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ) လႄႈ χ2 ၼႆႉ မွၵ်ႈ 1 ၼႆယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်းတႃႇၼပ်ႉသွၼ်ႇ။
လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈၸၢင်ႈပဵၼ်လႆႈ ၶွင် Mitochondria ။ ဝၢႆးသေ တွၼ်ႈဢၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉ လႆႈၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ တင်း 100 nM TMRM ဢၼ်ဢဝ်သႂ်ႇၵမ်းသိုဝ်ႈ တီႈၼႂ်း ACSF ဢၼ်ၸိုမ်းၶဝ်ႈဝႆႉၼၼ်ႉ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 30 မိၼိတ်ႉယဝ်ႉၼၼ်ႉ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်ၸၢင်ႈပဵၼ်လႆႈ ၶွင် mitochondrial ၶွင် PNs ၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်မီးသွင်ၽူဝ်ႇတၼ်ႇ တႅၵ်ႈဝႆႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈထႆႇႁၢင်ႈ TMRM ၼႆႉ လႆႈႁဵတ်းၸွမ်း လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၶိူင်ႈထတ်းသၢင် တီႈ 920 nm ၼၼ်ႉ ၸႂ်လမ်သေ ၸႂ်ႉတိုဝ်း HyD ဢၼ်မီးၼႂ်းတူဝ် (တႅတ်ႉထရႃႇမီႇတီႇရူဝ်ႇတမ်ႇမိၼ်ႇ ဢၢႆႇသူဝ်ႇထီႇဢူဝ်ႇသၢႆႇၼႅတ်ႉ: 585/40 nm) သေ ၵဵပ်းႁွမ် သၢႆငၢႆ၊ လူၺ်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း တၢင်းယၢဝ်းႁွၼ် ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၸႂ်လမ် မိူၼ်ၵၼ်သေတႃႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း HyD ၽၢႆႇၼႂ်း ဢၼ်ပိူင်ႈၵၼ် (FITC :525/50) တႃႇတေ ထႆႇႁၢင်ႈ mtYFP ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ပလၵ်ႉဢိၼ်ႇ ၶိူင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ၶွင် ImageJ သေ ထတ်းသၢင်တူၺ်း ၼမ်ႉၵတ်ႉ ဢဵၼ်ႁႅင်း တီႈၸၼ်ႉ သႄးလ် ဢၼ်လဵဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼႂ်းၵႅပ်ႈမၼ်း လွင်ႈၽဵင်ႇပဵင်း ဢၼ်ပႃးၼႂ်း ပလၵ်ႉဢိၼ်ႇ ဢၼ်ပဵၼ် သၢႆငၢႆ = min (mtYFP, TMRM) ၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်းတႃႇ မၵ်းမၼ်ႈ ပိုၼ်ႉတီႈ ဢဵၼ်ႁႅင်း ဢၼ်ၼႄပၼ် သၢႆငၢႆ TMRM ၼႂ်း Purkinje Somali ၼႂ်းၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်မီး ၸုတ်ႇလဵဝ် ၶွင် သၢႆတၢင်း ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ပိုၼ်ႉတီႈ pixel ၼႂ်းၽႃႈတူမ်းသူပ်းဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ လႆႈၼပ်ႉသွၼ်ႇဝႆႉသေယဝ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ်ၸွမ်းပိူင်မၼ်း ၼိူဝ်ၶႅပ်းႁၢင်ႈဢၼ်မီးထၢပ်ႈလဵဝ် ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ် ၶွင်သၢႆတၢင်း mtYFP တႃႇတေလႆႈမႃး ပွတ်းတွၼ်ႈ mitochondrial ဢၼ်ၼႄပၼ် ၼမ်ႉၵတ်ႉ mitochondrial ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ၶႅပ်းႁၢင်ႈၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ Huygens Pro (ပၢႆးသၢႆႊ ဢၼ်ထႆႇၶႅပ်းႁၢင်ႈ) သေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈမၼ်း ဢမ်ႇတႅတ်ႈၼႅတ်ႈ။ တွၼ်ႈတႃႇ ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်လႆႈ သၵ်ႈၵႅၼ်ႇ ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ၶႅပ်းႁၢင်ႈၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း လွၵ်းလၢႆး ဢၼ် LAS-X software ပၼ်ဝႆႉၼၼ်ႉသေ ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်လဵဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးသေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈၶႅပ်းႁၢင်ႈ လီလီယဝ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ImageJ လႄႈ Adobe Photoshop သေ ႁဵတ်းၵၢၼ် ၶႅပ်းႁၢင်ႈထႅင်ႈသေ ႁႂ်ႈမၼ်း ႁိူဝ်ႈလႅင်း လႄႈ ႁႂ်ႈမၼ်း ၽဵင်ႇပဵင်းၵၼ်။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း Adobe Illustrator တႃႇႁၢင်ႈႁႅၼ်း ၵရၢပ်ႉ။
mtDNA ဢၼ်ပၵ်းၸႂ်ထတ်းသၢင်။ တၢင်းၼမ် mtDNA ဢၼ်ပဵၼ်ႁွႆးၸဵပ်းၼၼ်ႉ လႆႈၼပ်ႉသွၼ်ႇဝႆႉတီႈ ပွတ်းတွၼ်ႈ cerebellar ဢၼ်မီး ၶူဝ်ႈၶွင်ဢၼ်ၶတ်းၶၢၼ်ႉ DNA လူၺ်ႈ မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉဢၼ်မီးတီႈလဵဝ်ၵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈဢၼ်ယိူင်းဢၢၼ်းဝႆႉ ၵူႊတီႈၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇမႃး တႃႇတူဝ်ၶိင်း သႄးလ် လႄႈ ၼယူးၵရီးယႃး သႄးလ် ၵူႊတီႈတီႈသေ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း Multi Measure plug-in (ImageJ software) သေ ၼပ်ႉသွၼ်ႇ ပိုၼ်ႉတီႈ ၽႂ်မၼ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ထွၼ်ဢွၵ်ႇ ပိုၼ်ႉတီႈၼိဝ်ႇၵလီးယႃး တီႈတူဝ်ၶိင်းသႄးလ်သေ လႆႈမႃး ပိုၼ်ႉတီႈ cytoplasmic ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လိုၼ်းသုတ်းမႃး ၸႂ်ႉတိုဝ်း ပလၵ်ႉဢိၼ်ႇ Analyze Particles (ImageJ software) သေ ၼပ်ႉသွၼ်ႇ ၸုတ်ႇၸုတ်ႇ DNA ဢၼ်ၼႄပၼ် mtDNA တီႈၼိူဝ် ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်မီးတီႈ ႁူးၽၵ်းတူၼၼ်ႉ လူၺ်ႈလၢႆးဢွမ်လူမ်းသေ ၶေႃႈတွပ်ႇဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းႁႂ်ႈမၼ်း ပဵၼ် PN ၽတ်ႉၽဵင်ႇ ၼူ CTRL ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶေႃႈတွပ်ႇမၼ်း လႆႈၼႄဝႆႉ မိူၼ်ၼင်ႇ တၢင်းၼမ် ၼယူးၵလီးယႅတ်ႉ ၽတ်ႉၽဵင်ႇ ၼႂ်းသႄးလ် ၼိုင်ႈဢၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢွၵ်ႇမႃး။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ပလၵ်ႉဢိၼ်ႇ ၶိူင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ၶွင် ImageJ သေ ထတ်းသၢင်တူၺ်း လွင်ႈထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢွၵ်ႇမႃး ၼႂ်း PN တီႈၸၼ်ႉ သႄးလ် ဢၼ်လဵဝ်ၼၼ်ႉ။ ၼႂ်းၵႅပ်ႈမၼ်း ၼႂ်းၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢၼ်မီးထၢပ်ႈလဵဝ် ဢၼ်ပဵၼ် ၶူဝ်လႆ ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်ၼၼ်ႉ လတ်းၽၢၼ်ႇ လွင်ႈၽဵင်ႇပဵင်း ဢၼ်ပဵၼ် သၢႆငၢႆ = min (mtYFP, antibody) ၼၼ်ႉ တီႈဢၼ် ႁႅင်းၶၢမ်ႇတူဝ် ဢၼ်ၼႄပၼ် လွင်ႈႁႅင်းၶၢမ်ႇတူဝ် တေႃႇ ၶူဝ်ႈၶွင် ဢၼ်ႁႄႉၵင်ႈ တၢင်းပဵၼ် တီႈၼႂ်း Purkina ၼၼ်ႉ လႆႈမၵ်းမၼ်ႈဝႆႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ပိုၼ်ႉတီႈ pixel ၼႂ်းၽႃႈတူမ်းသူပ်းဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ လႆႈၼပ်ႉသွၼ်ႇဝႆႉသေယဝ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ်ၸွမ်းပိူင်မၼ်း ၼိူဝ်ၶႅပ်းႁၢင်ႈဢၼ်မီးထႅဝ်လဵဝ် ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ် ၶွင် mtYFP channel တႃႇတေလႆႈမႃး ပွတ်းတွၼ်ႈ mitochondrial ၶွင် ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်းဢၼ်ၼႄဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
လွင်ႈထတ်းသၢင် တၢင်းၼႅၼ်ႈၼႃ သႄးလ် Purkinje ။ ပလၵ်ႉဢိၼ်ႇ Cell Counter ၶွင် ImageJ ၼႆႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်းတႃႇ ထတ်းသၢင် တၢင်းၼႅၼ်ႈၼႃ Purkinje လူၺ်ႈ ၸႅၵ်ႇၽႄ တၢင်းၼမ် သႄးလ် Purkinje ဢၼ်ၼပ်ႉဝႆႉ တင်းတၢင်းယၢဝ်း ဝူင်းဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်သႄးလ် ဢၼ်ၼပ်ႉဝႆႉၼၼ်ႉ ၵုမ်းၵမ်ဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ၵၢၼ်ႁၢင်ႈႁႅၼ်း လႄႈ ၵၢၼ်ၵဵပ်းတူဝ်ယၢင်ႇ။ ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၸုမ်းၵုမ်းထိင်း လႄႈ ၼူ Mfn2cKO ၼၼ်ႉ လႆႈမၼ်ႈၵိုမ်းဝႆႉ ၼႂ်း 2% PFA/2.5% ၵလူဝ်ႇတႃႇဢႄးလ်တီႇႁၢႆႉ ၼႂ်း 0.1 M ၽွတ်ႉသၽဵတ်ႉ ပၢပ်ႇပႃႇ (PB) သေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ လႆႈႁၢင်ႈႁႅၼ်း တွၼ်ႈၶူဝ်ႇရူဝ်ႇၼႃႇ လူၺ်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶူၼ်ႁူဝ် (Leica Mikrosysteme GmbH၊ တီႇထရႃႇဢွၵ်ႉသၢႆႉ လႄႈ ထၢတ်ႈပႃႇတီႇသီႇယမ်ႇ ၾႄႇရူဝ်ႇသၢႆႇၼၢႆႉ 1.5% တီႈ တၢင်းမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 1 ၸူဝ်ႈမူင်း။ ဢဝ်ၼမ်ႉဢၼ်ၸႅတ်ႈဝႆႉၼၼ်ႉ သုၵ်ႈပၼ် ပွတ်းတွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ သၢမ်ပွၵ်ႈသေ ဢဝ်ဢီႇတၼေႃး 70% ဢၼ်ပႃး ယူႊရႅၼ်ႊၼီႊလ် ဢႅတ်ႉသိတ်ႉ 1% ၼၼ်ႉ သႂ်ႇသီ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 20 မိၼိတ်ႉ။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ပွတ်းတွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇႁဵတ်းႁႂ်ႈၼမ်ႉယွမ်းလူင်း ၼႂ်းလဝ်ႈၸၼ်ႉထၢၼ်ႈသေ ဢဝ်သႂ်ႇၼႂ်း Durcupan ACM (Araldite casting resin M) ၼမ်ႉယၢင် epoxy (ပၢႆးသၢႆႊ မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢီႇလႅတ်ႇထရုၼ်ႇ၊ မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ 14040) ၼႂ်းၵေႈ ၽႅၼ်ႇမၢၼ်ႇဢၼ်သႂ်ႇဝႆႉ သီႇလီႇၵူၼ်ႇ လႄႈ လိုၼ်းသုတ်းမႃး တီႈ 60°C Polymerize ၼႂ်းၽိူၼ်48 hours ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လိူၵ်ႈဢဝ် ပိုၼ်ႉတီႈ ဢွၵ်းဢေႃဢွၵ်းဢေႃ လႄႈ ပွတ်းတွၼ်ႈ ဢၼ်မၢင်လိူဝ်ႁႅင်း 50 nm ၼၼ်ႉ လႆႈတတ်းဢွၵ်ႇ တီႈၼိူဝ် Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH၊ ဝဵင်းဝီႇယႅၼ်ႇၼႃႇ၊ ဢေႃးသထရီးယႃး) သေ လိူၵ်ႈဢဝ် တီႈၼိူဝ် ၶႅပ်းတွင်း ဢၼ်မီး 2×1 mm ဢၼ်ဢဝ် ၶႅပ်းထၢတ်ႈ polystyrene သႂ်ႇဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ဢဝ်ၼမ်ႉယႃႈ 4% uranyl acetate ၼႂ်း H2O သေ သုၵ်ႈသီပၼ် 10 မိၼိတ်ႉသေ ဢဝ် H2O သုၵ်ႈလၢႆပွၵ်ႈ ယဝ်ႉၵေႃႈ ဢဝ် Reynolds lead citrate ၼႂ်း H2O သေ သုၵ်ႈသီပၼ် 10 မိၼိတ်ႉ ယဝ်ႉၵေႃႈ သုၵ်ႈသီပၼ် လၢႆပွၵ်ႈ။ ၶႅပ်းႁၢင်ႈဢၼ်လဵၵ်ႉၼၼ်ႉ ဢဝ်မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း ဢီႇလႅတ်ႇထရွၼ်ႇ ဢၼ်သူင်ႇၶၢဝ်ႇ Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific၊ ၵျႃႇမၼီႇ)။
တွၼ်ႈတႃႇၼူၸိူဝ်းဢၼ်ၸပ်းတၢင်းပဵၼ် AAV ၼၼ်ႉ ဢွၵ်းဢေႃၼၼ်ႉ လႆႈၽၢတ်ႇဢွၵ်ႇသေ တႅပ်းပဵၼ် ပွတ်းတွၼ်ႈ sagittal ဢၼ်ၼႃ 1 mm သေ ဢဝ်မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်မီးသၢႆလႅင်းသေ ထတ်းတူၺ်း ဢွၵ်းဢေႃဢွၼ်ႇၼၼ်ႉ တႃႇတေႁူႉလႆႈ ဝူင်းဢၼ်ၸပ်းတၢင်းပဵၼ် AAV (ပွင်ႇဝႃႈ mCherry expressing) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်း ဢၼ်သမ်း AAV ႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ ဢၼ်မီးၼမ်ႉတွၼ်း သုင်လိူဝ်ႁႅင်း ၶွင်ထၢပ်ႈသႄးလ် Purkinje (ပွင်ႇဝႃႈ ၶႂ်ႈၸမ်ထၢပ်ႈတင်းမူတ်း) ၼႂ်းဝူင်းဢွၵ်းဢေႃ တီႈဢေႇသုတ်းမၼ်း သွင်ဢၼ်ထပ်းၵၼ်ၼၼ်ႉၵူၺ်း ၸႂ်ႉတိုဝ်း။ လွၵ်းဢၼ် AAV လႅၵ်ႈလၢႆႊဝႆႉၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇတတ်းဢွၵ်ႇ တႃႇၶိုၼ်းမၼ်ႈၵိုမ်း (4% PFA လႄႈ 2.5% glutaraldehyde ၼႂ်း 0.1 M ၵူဝ်ႇၵူဝ်ႇ) သေယဝ်ႉ ႁဵတ်းၵၢၼ်ထႅင်ႈ။ တႃႇတေဢဝ် EPON သႂ်ႇဝႆႉၼၼ်ႉ ဢဝ်ၼမ်ႉယႃႈယႃ 0.1 M သေ သုၵ်ႈသီပၼ် တိတ်ႉသျူးဢၼ်မၼ်ႈၵိုမ်းၼၼ်ႉသေ ဢဝ် OsO4 2% (os, Science Services; Caco) သေ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ ၼႂ်းၼမ်ႉယႃႈယႃ 0.1 M သေ သုၵ်ႈပၼ် 2 ၸူဝ်ႈမူင်းယဝ်ႉ။ ဢဝ်ၼမ်ႉယႃႈယႃ ၶူဝ်ႇၵႃႇမၢႆႉ 0.1 M သေ ႁဵတ်းထႅင်ႈ 3 ပွၵ်ႈ။ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ဢီႇတၼေႃး ဢၼ်ၶိုၼ်ႈမႃးၼၼ်ႉသေ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈ ဢီႇတၼေႃး ဢၼ်ယွမ်ႉသီဝႆႉ တီႈ 4°C တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 15 မိၼိတ်ႉ တႃႇႁႂ်ႈ တိတ်ႉသျူး လူႉလႅဝ်ၵႂႃႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢဝ်တိတ်ႉသျူးၼၼ်ႉ သူင်ႇၵႂႃႇတီႈ ပရူဝ်ႇပိၼ်ႇဢွၵ်ႉသၢႆႉသေ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ ၼႂ်း EPON (Sigma-Aldrich) ၶိုၼ်းၼိုင်ႈ တီႈ 4°C ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢဝ်တိတ်ႉသျူးၼၼ်ႉ သႂ်ႇၼႂ်း EPON ဢၼ်မႂ်ႇ ဢၼ်မီးတၢင်းမႆႈၼႂ်းႁွင်ႈ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 2 ၸူဝ်ႈမူင်းသေ ဢဝ်သႂ်ႇၼႂ်း 62°C တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 72 ၸူဝ်ႈမူင်း။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈထတ်းထၢတ်ႈ ဢၼ်လဵၵ်ႉၼွႆႉ (Leica Microsystems, UC6) လႄႈ ၶိူင်ႈထၢတ်ႈႁိၼ် (Diatome, Biel, Switzerland) သေ တႅပ်း ပွတ်းတွၼ်ႈ ဢၼ်မၢင်လိူဝ်ႁႅင်း 70 nm သေ ဢဝ် ယူးရၢၼ်ႇၼိတ်ႉ ဢႅတ်ႉသိတ်ႉ 1.5% မႃးယွမ်ႉသီ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 15 မိၼိတ်ႉ တီႈ 37°C သေ ဢဝ်ယွမ်ႉသီ 4 မိၼိတ်ႉ ၼႆယဝ်ႉ။ ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢီႇလႅတ်ႇထရွၼ်ႇ ဢၼ်ဢဝ် ၶိူင်ႈထႆႇ ဢီႇလႅတ်ႇထရွၼ်ႇ ဢၼ်သူင်ႇၶၢဝ်ႇ JEM-2100 Plus (JEOL) ဢၼ်ပႃး ၵွင်ႈထႆႇ OneView 4K 16-bit (Gatan) လႄႈ ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ DigitalMicrograph (Gatan) ၼၼ်ႉ ဢဝ်မႃးထႆႇဝႆႉ။ တႃႇတေထတ်းသၢင်တူၺ်းၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် ၶႅပ်းႁၢင်ႈ ဢီႇလႅတ်ႇထရုၼ်ႇ ဢၼ်လဵၵ်ႉၼွႆႉၼၼ်ႉ မႃးၸႂ်ႉတိုဝ်း 5000× ဢမ်ႇၼၼ် 10,000× ၸိတ်ႉၸိတ်ႉၸူမ်း။
လွင်ႈထတ်းသၢင် ပိူင်ၾၢင် ၶွင် ဢဵၼ်ႁႅင်း ဢွၵ်းဢေႃ။ တွၼ်ႈတႃႇလွင်ႈထတ်းသၢင်ႈတၢင်းမူတ်းၼၼ်ႉ၊ ၵူၼ်ႇတူဝ်ႇၶွင် mitochondria ၵူႈဢၼ်ဢၼ်ၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ်မိုဝ်းသေ ၶဵၼ်ႇတႅမ်ႈဝႆႉၼ်ႂးၶႅပ်းႁၢင်ႊ တီႇၸီႇတႄႇ ဢၼ်ၸ်ႂႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ ImageJ ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈပိူင်ၾၢင် ဢၼ်ပႅၵ်ႇပိူင်ႈၵၼ်ၼၼ်ႉ လႆႈထတ်းသၢင်တူၺ်း။ လွင်ႈၼႅၼ်ႈၼႃ ၶွင် Mitochondria ၼႆႉ လႆႈၼႄပဵၼ် ႁူဝ်ပၢၵ်ႇ ဢၼ်လႆႈမႃး လူၺ်ႈ ၸႅၵ်ႇၽႄ တၢင်းၵႂၢင်ႈ ဢဵၼ်ႁႅင်း ၼႂ်းသႄးလ် ၵူႊဢၼ်ဢၼ် တင်း တၢင်းၵႂၢင်ႈ သႄးလ် (ပိုၼ်ႉတီႈ သႄးလ် = တၢင်းၵႂၢင်ႈ သႄးလ်-ပိုၼ်ႉတီႈ ၼယူးၵရီးယႃး သႄးလ်) × 100 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပိူင်ၾၢင် ista ၶွင် mitochondria ၼၼ်ႉ လႆႈထတ်းသၢင်တူၺ်းသေ ၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇပဵၼ် သွင်မဵဝ်း (“လွတ်ႇ” လႄႈ “ပဵၼ်ႁွႆး”) ၸွမ်းၼင်ႇ ပိူင်ၾၢင်ပိူင်လူင်ၶဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
လွင်ႈထတ်းသၢင် တၢင်းၼမ် ဢူဝ်ႇတူဝ်ႇၾႃႇၵူဝ်ႇသူမ်း/လၢႆႇသူဝ်ႇသူမ်း လႄႈ တၢင်းၼႅၼ်ႈၼႃ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ ImageJ သေ ဢဝ်မိုဝ်းသေ တႅမ်ႈၼႄ ၵူၼ်ႇတူဝ်ႇ ၶွင် ဢူဝ်ႇတူဝ်ႇၾႃႇၵူဝ်ႇသူမ်း/လၢႆႇသူဝ်ႇသူမ်း ၵူႊဢၼ်ဢၼ် ၼႂ်းၶႅပ်းႁၢင်ႈ ၸိတ်ႉတိယၼၼ်ႉ။ ၼႃႈလိၼ် ဢူဝ်ႇတူဝ်ႇၽႃႇၵူဝ်ႇသူမ်း/လၢႆႇသူဝ်ႇသူမ်းၼႆႉ ၼေဝႆႉ ပဵၼ်ႁူဝ်ပၢၵ်ႇ ဢၼ်ၼပ်ႉသွၼ်ႇ လူၺ်ႈ ၸႅၵ်ႇၽႄ ၼႃႈလိၼ် ၵေႃႇသၢင်ႈ ဢူဝ်ႇတူဝ်ႇၽႃႇၵူဝ်ႇသူမ်း/လၢႆႇသူဝ်ႇသူမ်း တင်းမူတ်း ၶွင် သႄးလ် ၵူႊဢၼ် လူၺ်ႈ ၼႃႈလိၼ် သႄးလ် (ၼႃႈလိၼ် သႄးလ်=ၼႃႈလိၼ် ၼယူးၵရီးယႃး)×100 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၼႅၼ်ႈၼႃ ၶွင် ဢူဝ်ႇတူဝ်ႇၽႃႇၵူဝ်ႇသူမ်း/လၢႆႇသူဝ်ႇသူမ်းၼႆႉ ဢဝ် ႁူဝ်ၼပ်ႉတင်းမူတ်း ၸႅၵ်ႇၽႄ တင်း တၢင်းၼမ် ဢူဝ်ႇတူဝ်ႇၽႃႇၵူဝ်ႇသူမ်း/လၢႆႇသူဝ်ႇသူမ်း ဢၼ်ၵေႃႇသၢင်ႈဝႆႉ ၼႂ်းသႄးလ် ၼိုင်ႈဢၼ် (ပေႃးဢဝ် ပိုၼ်ႉတီႈ သႄးလ်) (ပိုၼ်ႉတီႈ သႄးလ် = ပိုၼ်ႉတီႈ သႄးလ်-ၼႃႈလိၼ် ၼိဝ်ႇၵလီးယႃး) သေ ၼပ်ႉသွၼ်ႇ။
ၵၢၼ်တၢင်ႇမၢႆ တႃႇတႅၵ်ႇယၢႆႈ လႄႈ တႃႇႁၢင်ႈႁႅၼ်းတူဝ်ယၢင်ႇ။ တႃႇလွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်း ဢၼ်လူဝ်ႇ လွင်ႈတၢင်ႇမၢႆ ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇၼၼ်ႉ ဢဝ် ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉ သူင်ႇၵႂႃႇတီႈ ႁွင်ႈဢၼ်ပႆႇၽုၵ်ႇသွမ်ႈ ဢၼ်ပႃး ထၢတ်ႈၵႃႇပုၼ်ႇ ဢၼ်ၸိုၼ်ႈသႂ် (95% O2 လႄႈ 5% CO2)၊ 25.0 mM d-ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇ 1.0 mM CaCl 2 လႄႈ 2.0 mM MgCl 2 သေ မူၼ်ႉမႄး ႁႂ်ႈပဵၼ် pH 7.4 လႄႈ 310 တေႃႇထိုင် 320 mOsm သေ ၼႂ်းၼၼ်ႉ ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇ ပဵၼ် 13 C 6- ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇ ဢၼ်တႅၼ်းတၢင် (Eurisotop, မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ CLM9-1) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်း ဢၼ်လူဝ်ႇ လွင်ႈတၢင်ႇမၢႆ ပၢႆႇရူဝ်ႇဝႅတ်ႉၼၼ်ႉ ဢဝ် ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်ႁၢဝ်ႈႁႅင်းၼၼ်ႉ သူင်ႇပၼ် တီႈ Ca2 + ACSF ဢၼ်သုင်လိူဝ်ၼၼ်ႉ (NaCl 125.0 mM၊ KCl 2.5 mM၊ သူဝ်ႇတီႇယမ်ႇၽွတ်ႉသၽဵတ်ႉ 1.25 mM၊ NaHCO3 25.0 mM၊ Ad2C mM d-glucose 25.0 mM၊ MgCl2 သေ ႁႂ်ႈ pH 7.4 လႄႈ 310 ထိုင် 320mOsm သေ ဢဝ် 1-[1-13C]ပၢႆႇရူဝ်ႇဝႅတ်ႉ 1mM (Eurisotop, မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ CLM-1082) သႂ်ႇထႅင်ႈ။ ဢဝ်တွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ တီႈ 37°C တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 90 မိၼိတ်ႉ။ ဝၢႆးသေ လွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်းယဝ်ႉတူဝ်ႈၵႂႃႇယဝ်ႉ ဢဝ်ၼမ်ႉယၢင် (pH 7.4) ဢၼ်ပႃး ဢႃႇမွၼ်ႇၼီႇယမ်ႇ ၵႃႇပုၼ်ႇၼႅတ်ႉ 75 mM ၼၼ်ႉ သုၵ်ႈပၼ် ပွတ်းတွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ဝႆးဝႆးသေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ် ဢၼ်လဵဝ်ၵၼ် ၼႂ်း 40:40:20 (v:v:v) ဢႅတ်ႉသိတ်ႉၼိတ်ႉထရၢႆႉ (ACN): မီႇတႅၼ်ႇၼေႃး: ၼမ်ႉ။ ဝၢႆးသေ ဢဝ်ပွတ်းတွၼ်ႈၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉၼိူဝ်ၼမ်ႉၶႅင် ၶၢဝ်းတၢင်း 30 မိၼိတ်ႉယဝ်ႉ ဢဝ်တူဝ်ယင်ႇၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉတီႈ 21,000 g တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 10 မိၼိတ်ႉ တီႈ 4°C သေယဝ်ႉ ၼမ်ႉဢၼ်ၸႅင်ႈလႅင်းၼၼ်ႉ ဢဝ်ႁႅင်ႈဝႆႉၼႂ်း ၶိူင်ႈၸုတုမ် SpeedVac ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼမ်ႉတွၼ်းဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ လႆႈသိမ်းဝႆႉတီႈ -80°C တေႃႇထိုင် ပေႃးလႆႈထတ်းသၢင်တူၺ်းယဝ်ႉ။
လွင်ႈထတ်းသၢင် ၶရူဝ်ႇမႃႇထူဝ်ႇၵရႃႇၽီႇ ဢၼ်မီးၼမ်ႉၼၵ်း ၶွင် ဢႃႇမၢႆၼူဝ်ႇဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ဢၼ်မီးပၢႆႉ C 13 ဢၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈထတ်းသၢင် ၶရူဝ်ႇမႃႇထူဝ်ႇၵရႃႇၽီႇ ဢၼ်ပဵၼ်ၼမ်ႉ (LC-MS) ၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် မၢၵ်ႇႁိၼ် ဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼၼ်ႉ ၶိုၼ်းယွမ်ႉသႂ်ႇ ၼႂ်းၼမ်ႉ ၸၼ်ႉ LC-MS (Honeywell) 75μl ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးသေ ဢဝ် 21,000 g သေ 5 မိၼိတ်ႉ တီႈ 4°C ၼၼ်ႉယဝ်ႉ ဢဝ်ၼမ်ႉဢၼ်ၸႅင်ႈလႅင်း 20 μl ၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်းတႃႇ ထတ်းသၢင် amino acid flux သေ ဢၼ်ၵိုတ်းဝႆႉၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်းတႃႇ ထတ်းသၢင် anion ၵမ်းလဵဝ် (တူၺ်းတီႈတႂ်ႈ)။ လွင်ႈထတ်းသၢင် ဢႃႇမၢႆၼူဝ်ႇဢႅတ်ႉသိတ်ႉၼႆႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း လၢႆးႁဵတ်းသၢင်ႈ ဢၼ်လႆႈလၢတ်ႈၼႄဝႆႉ မိူဝ်ႈဢွၼ်တၢင်းၼၼ်ႉသေ ႁဵတ်းဢွၵ်ႇမႃး (55, 56) ၼႆယဝ်ႉ။ ၼႂ်းၶၵ်ႉတွၼ်ႈဢွၼ်တၢင်းသုတ်းၼၼ်ႉ ဢဝ်ထၢတ်ႈ သွတ်ႉတီႇယမ်ႇ ၵႃႇပုၼ်ႇၼႅတ်ႉ 100 mM (Sigma-Aldrich) 10 μl သႂ်ႇၼႂ်း ၼမ်ႉယႃႈယႃ ဢၼ်ဢွၵ်ႇမႃးတီႈ 20 μl သေ ဢဝ်ထၢတ်ႈ ပႅၼ်ႇၸူဝ်ႇၶရူဝ်ႇရၢႆႉ 2% (Sigma-Aldrich) 10 μl သႂ်ႇၼႂ်း ACN ၸၼ်ႉ LC ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တူဝ်ယင်ႇၼၼ်ႉ ဢဝ်ဝူင်းပၼ်ႇႁွပ်ႈ ၵမ်းဢွၼ်ႇၼိုင်ႈသေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ဢဝ် 21,000 g ၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ် 5 မိၼိတ်ႉ တီႈ 20°C ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢဝ်ၼမ်ႉဢၼ်ၸိုၼ်ႈသႂ်ၼၼ်ႉ သူင်ႇသႂ်ႇၼႂ်းထူင် 2 ml ဢၼ်ဢဝ်မၢၼ်ႇ ဢၼ်ပဵၼ်ႁၢင်ႈမူၼ်း သႂ်ႇဝႆႉ (တၢင်းၼမ် 200 μl) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တူဝ်ယၢင်ႇၸိူဝ်းၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း လွၵ်းလၢႆး LC ဢၼ်ႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈ သုင်သုတ်း ဢၼ်ပဵၼ် Acquity iClass (Waters) ဢၼ်ၵွင်ႉသၢၼ်ၵၼ်တင်း ၶိူင်ႈထတ်းသၢင် သၢႆလႅင်း ဢၼ်မီး လွင်ႈတႅတ်ႈၼႅတ်ႈ သုင်သုတ်း ဢၼ်ပဵၼ် Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) ၼၼ်ႉသေ ထတ်းသၢင်တူၺ်းယဝ်ႉ။ တႃႇတေထတ်းသၢင်တူၺ်းၼၼ်ႉ ဢဝ်တူဝ်ယၢင်ႇဢၼ်လႆႈမႃးတီႈ 2μl ၼၼ်ႉ သႂ်ႇၼႂ်းထမ်ႈ သီႇလီႇၵႃႇ T3 ဢၼ်မီးႁႅင်းသုင် 100×1.0 mm (Waters) ဢၼ်ပႃး ၽုၼ်ႇထၢတ်ႈ 1.8μm ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼမ်ႉလႆ 100μl/min သေ ၼႂ်းပိူင် ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ်ၼၼ်ႉ ပႃးဝႆႉ ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ် A (ဢႃႇမွၼ်ႇၼိမ်ႇၾူမ်း 10 mM လႄႈ ၾူမ်းဢႅတ်ႉသိတ်ႉ 0.15% ၼႂ်းၼမ်ႉ) လႄႈ ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ် B (ACN) ၼႆယဝ်ႉ။ ၵရဵတ်ႉမၼ်း မီးၼင်ႇၼႆ 0%B မိူဝ်ႈ 0 မိၼိတ်ႉ၊ 0% ၶ။ 0 တေႃႇ 15% B တီႈ 0 တေႃႇ 0.1 မိၼိတ်ႉ၊ 15 တေႃႇ 17% B တီႈ 0.1 တေႃႇ 0.5 မိၼိတ်ႉ၊ B တီႈ 17 တေႃႇ 55% တီႈ 0.5 တေႃႇ 14 မိၼိတ်ႉ၊ B တီႈ 55 တေႃႇ 70% မိူဝ်ႈ 14 တေႃႇ 14.5 မိၼိတ်ႉ၊ တီႈ 14.5 တေႃႇထိုင် 70 တေႃႇထိုင် 100% B မိူဝ်ႈ 18 မိၼိတ်ႉ၊ 100% B မိူဝ်ႈ 18 တေႃႇ 19 မိၼိတ်ႉ၊ 100 တေႃႇ 0% B မိူဝ်ႈ 19 တေႃႇ 19.1 မိၼိတ်ႉ၊ 0% B မိူဝ်ႈ 19.1 တေႃႇထိုင် 28 မိၼိတ်ႉ (55, 56)။ ၶိူင်ႈထတ်းသၢင် ၼမ်ႉၼၵ်း QE-HF ၼႆႉ ႁဵတ်းၵၢၼ် ၼႂ်းလၢႆး ဢၢႆႇယွၼ်ႇ ဢၼ်ပဵၼ် ၽွၼ်းလီ ဢၼ်မီး ၼမ်ႉၼၵ်း m/z (ၼမ်ႉၼၵ်း/ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ) 50 တေႃႇထိုင် 750 ၼၼ်ႉသေ လွင်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း လွင်ႈၶႅမ်ႉလႅပ်ႈၼၼ်ႉ ပဵၼ် 60,000 သေ လွင်ႈၵုမ်းထိင်း လွင်ႈလႆႈ (AGC) ဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ ပဵၼ် 3×106 သေ ၶၢဝ်းယၢမ်း ဢၢႆႇယွၼ်ႇ ဢၼ်သုင်သုတ်းၼၼ်ႉ ပဵၼ် millico100 ယဝ်ႉ။ ငဝ်ႈတိုၼ်း ဢၢႆႇဢူဝ်ႇၼိတ်ႉ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၾႆးၾႃႉ ဢၼ်မႆႈ (ESI) ၼႆႉ ႁဵတ်းၵၢၼ် တီႈ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ၽုၺ်ႇ 3.5 kV ၊ တၢင်းမႆႈ သဵၼ်ႈလိူတ်ႈ 250°C ၊ လူမ်းလႆ ၼႂ်းထူင် 60 AU (ယူးၼိတ်ႉ ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ၵၼ်) လႄႈ လူမ်းလႆ ဢၼ်ၸွႆႈထႅမ် 20 AU ၼႆယဝ်ႉ။ 250°C ။ မၢၼ်ႇ S ၼႆႉ မၼ်းတင်ႈဝႆႉ 60 AU ။
လွင်ႈထတ်းသၢင် ဢၢႆႇယွၼ်ႇ ၶရူဝ်ႇမႃႇထူဝ်ႇၵရႃႇၽီႇ-MS ၶွင် ဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ဢေႃႇၵႅၼ်းၼိၵ်ႉ ဢၼ်မီးပၢႆႉ 13C ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼမ်ႉယၢင်ဢၼ်ၵိုတ်းဝႆႉ (55μl) ၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း လွၵ်းလၢႆး ၶရူဝ်ႇမႃႇထူဝ်ႇၵရႃႇၽီႇ ဢၢႆႇယွၼ်ႇ Dionex (ICS 5000+, ပၢႆးသၢႆႊ ထႃႇမူဝ်ႇၾိတ်ႉသျႃး) ဢၼ်ၵွင်ႉသၢၼ်ၵၼ်တင်း ၶိူင်ႈထတ်းသၢႆလႅင်း ဢၼ်မီးၼမ်ႉၼၵ်း QE-HF (ထႃႇမူဝ်ႇၾိတ်ႉသျႃးပၢႆးသၢႆႊ) ၼၼ်ႉသေ ထတ်းသၢင်တူၺ်းယဝ်ႉ။ ၼႂ်းၵႅပ်ႈမၼ်း ဢဝ်ၼမ်ႉယႃႈယႃ ဢၼ်ဢွၵ်ႇမႃးတီႈ ထၢတ်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႊ 5 μl ၼၼ်ႉ သမ်းသႂ်ႇၼႂ်း ထမ်ႈ Dionex IonPac AS11-HC ဢၼ်ပႃး HPLC (2 mm×250 mm, တၢင်းယႂ်ႇၽုၼ်ႇ 4μm၊ thermo Fisher Scientific) ၼႂ်းလၢႆး တဵၵ်းၶဝ်ႈ ဢၼ်ပဵၼ် လွၵ်း ဢၼ်မီး တၢင်းၼမ် ဢၼ်တဵမ်ထူၼ်ႈ 1. )ၼိူဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ သဝ်ပႂ်ႉ တီႇဢူဝ်ႇၼႅၵ်ႉ ဢၢႆႇယွၼ်ႇပႅၵ်ႉ AG11-HC (2 မီႇလီႇမီႇတႃႇ x 50 မီႇလီႇမီႇတႃႇ၊ 4μm၊ ထႃႇမူဝ်ႇၾိတ်ႉသျႃး ပၢႆးသၢႆႊ)။ တၢင်းမႆႈ ၶူဝ်ႇလူဝ်ႇၼီႇၼၼ်ႉ ဝႆႉဝႆႉ 30°C သေ ၶိူင်ႈထတ်းတူၺ်း ဢၼ်ႁဵတ်းႁင်းမၼ်းၼၼ်ႉ ဝႆႉဝႆႉ 6°C ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၵွၼ်ႈထၢတ်ႈ ပႃႇတီႇသီႇယမ်ႇ ႁၢႆႇထရူဝ်ႇဢွၵ်ႉသၢႆႉ ဢၼ်ပၼ်ဝႆႉ ၼမ်ႉဢၼ်ဢမ်ႇမီး ဢၢႆႇဢူဝ်ႇၼိတ်ႉၼၼ်ႉသေ ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ထၢတ်ႈပႃႇတီႇသီႇယမ်ႇ ႁၢႆႇထရူဝ်ႇဢွၵ်ႉသၢႆႉ ဢၼ်လတ်းၽၢၼ်ႇ ၶိူင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ထၢတ်ႈပႃႇတီႇသီႇယမ်ႇ ႁၢႆႇထရူဝ်ႇဢွၵ်ႉသၢႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၽၢတ်ႇဢွၵ်ႇ ထၢတ်ႈဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ၼႂ်းတူဝ်ၶိင်း ဢၼ်မီး တၢင်းလႆ 380μl/min သေ ၸႂ်ႉတိုဝ်း လွၵ်းလၢႆး ဢၼ်ပႃႈတႂ်ႈၼႆႉ 0 တေႃႇထိုင် 3 မိၼိတ်ႉ 10 mM KOH ၊ 3 တေႃႇ 12 မိၼိတ်ႉ 10 တေႃႇ 50 mM KOH ၊ 12 တေႃႇ 19 မိၼိတ်ႉ 50 တေႃႇ 100 mM KOH ၊ 19 တေႃႇထိုင် 21 မိၼိတ်ႉ , 100 mM KOH ၊ 21 တေႃႇ 21.5 မိၼိတ်ႉ 100 တေႃႇ 10 mM KOH ။ ၶိုၼ်းဢဝ် ၶူဝ်ႇလူဝ်ႇၼီႇ ၽဵင်ႇပဵင်းၵၼ် တႂ်ႈ 10 mM KOH တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 8.5 မိၼိတ်ႉ။
ၶူဝ်းၶွင်ဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ဢၼ်ဢွၵ်ႇမႃးၼၼ်ႉ ဢဝ်မႃးႁူမ်ႈၵၼ်တင်း ၼမ်ႉယႃႈယႃ ၽိူမ်ႉထႅမ် isopropanol 150μl/min ဝၢႆးသေ သဝ်ၼၼ်ႉသေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ၸီႉၼႄၵႂႃႇတီႈ ၶိူင်ႈထတ်းသၢင် သၢႆလႅင်း ဢၼ်မီး လွင်ႈႁၼ်လႆႈသုင် ဢၼ်ႁဵတ်းၵၢၼ် ၼႂ်းပိူင် ဢၢႆႇဢူဝ်ႇၼိတ်ႉ ဢၼ်ဢမ်ႇလီၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ MS ၼႆႉ မၼ်းပႂ်ႉတူၺ်း တၢင်းၼမ် m/z 50 တေႃႇထိုင် 750 ဢၼ်မီး လွင်ႈၶႅမ်ႉလႅပ်ႈ 60,000 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ AGC ၼႆႉ လႆႈတမ်းဝႆႉ 1×106 သေ ၶၢဝ်းယၢမ်း ဢၢႆႇယွၼ်ႇ ဢၼ်သုင်သုတ်းၼၼ်ႉ လႆႈဝႆႉ 100 ms ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶိူင်ႈထၢတ်ႈ ESI ဢၼ်မႆႈၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ၽုၺ်ႇ 3.5 kV ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈတမ်းဝၢင်း ငဝ်ႈတိုၼ်း ဢၢႆႇယွၼ်ႇ တၢင်ႇဢၼ်တႄႉ ပဵၼ်ၸိူင်ႉၼႆ- တၢင်းမႆႈ ၶႅပ်ႇပီႇလႃႇ 275°C၊ ၵႅတ်ႉသ် ဢၼ်လႆ 60 AU ၊ လွင်ႈလႆၵႅတ်ႉသ် ဢၼ်ၸွႆႈထႅမ် 20 AU တီႈ 300°C လႄႈ လွင်ႈတမ်းဝၢင်း မၢၼ်ႇ S ႁႂ်ႈပဵၼ် 60 AU ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ၵၢၼ်ထတ်းသၢင်ၶေႃႈမုၼ်း ၶွင် 13C ဢၼ်မီးမၢႆတွင်းဝႆႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ TraceFinder (ပိူင် 4.2၊ ပၢႆးသၢႆႊ ထႃႇမူဝ်ႇၾိတ်ႉသျႃး) တႃႇထတ်းသၢင်ၶေႃႈမုၼ်း တၢင်းၼမ်ၵေႇ ဢၢႆႇသူဝ်ႇတူဝ်ႇပႃႇ။ လွင်ႈမၵ်းမၼ်ႈၶွင် ထၢတ်ႈပွင်းၵူႈဢၼ်ၼႆႉ လႆႈထုၵ်ႇမၵ်းမၼ်ႈလူၺ်ႈ ထၢတ်ႈပွင်းဢၼ်ပဵၼ်ၽိုၼ်ဢိင်ဢၼ်ယုမ်ႇယမ်လႆႈသေယဝ်ႉ လႆႈထတ်းသၢင်တူၺ်းလွတ်ႈလွတ်ႈလႅဝ်းလႅဝ်းယူႇယဝ်ႉ။ တႃႇတေႁဵတ်းၵၢၼ် ထတ်းသၢင် လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ ဢၢႆႇသူဝ်ႇတူဝ်ႇ ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇၼၼ်ႉ လႆႈထွင်ဢွၵ်ႇ ပိုၼ်ႉတီႈ ဢၢႆႇယွၼ်ႇ ၶရူဝ်ႇမႃႇတူဝ်ႇၵရမ်ႇ (XIC) ၶွင် ဢၢႆႇသူဝ်ႇတူဝ်ႇ 13C (Mn) ၵူႊဢၼ်ဢၼ် တီႈ [M + H] + သေ n ၼႆႉ ပဵၼ် တူဝ်ၼပ်ႉ ၵႃႇပုၼ်ႇ ၶွင် ထၢတ်ႈပွင်း ဢၼ်ယိူင်းဢၢၼ်းဝႆႉၼၼ်ႉသေ ၸႂ်ႉတိုဝ်း တႃႇထတ်းသၢင် ဢႃႇမၢႆၼူဝ်ႇဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ဢမ်ႇၼၼ် [ MH] + ၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း တႃႇထတ်းသၢင် ဢၢႆႇယွၼ်ႇ ၼႆယဝ်ႉ။ လွင်ႈတႅတ်ႈၼႅတ်ႈ ၼမ်ႉၼၵ်း XIC ၼႆႉ ဢမ်ႇတဵမ် ႁႃႈတွၼ်ႈ ၼႂ်းၼိုင်ႈလၢၼ်ႉသေ လွင်ႈတႅတ်ႈၼႅတ်ႈ RT သမ်ႉ မီး 0.05 မိၼိတ်ႉ။ လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇၼႆႉ ႁဵတ်းလူၺ်ႈ ၼပ်ႉသွၼ်ႇ တၢင်းၼမ်ဢေႇ ၶွင် isotope ဢၼ်သွၵ်ႈႁၼ်ဝႆႉ ၵူႈဢၼ်ဢၼ် တင်း isotope တင်းမူတ်း ၶွင် ထၢတ်ႈလေႃး ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တၢင်းၼမ်ဢေႇၸိူဝ်းၼႆႉ ပၼ်ဝႆႉ မိူၼ်ၼင်ႇ ၵႃႈၶၼ်ႁူဝ်ပၢၵ်ႇ တွၼ်ႈတႃႇ isotope ၵူႈဢၼ်ဢၼ်သေ ၶေႃႈတွပ်ႇမၼ်းၼၼ်ႉ ၼႄဝႆႉ မိူၼ်ၼင်ႇ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇႁူဝ်ပၢၵ်ႇ molar (MPE) မိူၼ်ၼင်ႇ လႆႈလၢတ်ႈၼႄဝႆႉ မိူဝ်ႈဢွၼ်တၢင်းၼၼ်ႉ (42)။
မၢၵ်ႇဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ၶႅင်ဝႆႉၼၼ်ႉ ဢဝ်မႃးႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ် ဢၼ်လဵဝ်ၵၼ် ၼႂ်းၼမ်ႉၶႅင် 80% methanol (v/v) သေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ် ၼမ်ႉၶႅင်သေ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ တီႈ -20°C တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 30 မိၼိတ်ႉယဝ်ႉ။ ၶိုၼ်းဢဝ်တူဝ်ယၢင်ႇၼၼ်ႉ ၶူၼ်းသႂ်ႇတီႈ +4°C တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 30 မိၼိတ်ႉ။ တူဝ်ယင်ႇၼၼ်ႉ ဢဝ် 21,000 g တီႈ 4°C တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 5 မိၼိတ်ႉသေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ၼမ်ႉဢၼ်ဢွၵ်ႇမႃးၼၼ်ႉ ဢဝ် SpeedVac concentrator သေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈႁႅင်ႈ တီႈ 25°C တႃႇတေထတ်းသၢင်တူၺ်း ဝၢႆးလင်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ မိူၼ်ၼင်ႇ လႆႈလၢတ်ႈၼႄမႃးပႃႈၼိူဝ်ၼၼ်ႉ လွင်ႈထတ်းသၢင် LC-MS ၼႆႉ လႆႈႁဵတ်းၼိူဝ် amino acids ၶွင် သႄးဢၼ်ၸႅၵ်ႇၽႄဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း TraceFinder (ပိူင် 4.2၊ ပၢႆးသၢႆႊ Thermo Fisher) သေ လွင်ႈထတ်းသၢင်ၶေႃႈမုၼ်းၼႆႉ လႆႈႁဵတ်းသၢင်ႈမႃး လူၺ်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၼမ်ႉၼၵ်း ဢၼ်မီး ဢၢႆႇသူဝ်ႇတူဝ်ႇပိၵ်ႉ ၶွင် ထၢတ်ႈပွင်း ၵူႊဢၼ်ဢၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈ ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊ ၼႂ်းတူဝ်ၶိင်း ပဵၼ်ၸွမ်းပိူင်မၼ်းၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ preprocessCore (57) သေ ႁဵတ်းသၢင်ႈမႃးယဝ်ႉ။
လွင်ႈႁၢင်ႈႁႅၼ်း ၽိုၼ်လိၵ်ႈ။ ၼူၼၼ်ႉ ဢဝ်ထၢတ်ႈၵႃႇပုၼ်ႇတၢႆႇဢွၵ်ႇသၢႆႉ သေ တႅပ်းႁူဝ်မၼ်း ဝႆးဝႆးသေ ဢဝ်ဢွၵ်းဢေႃမၼ်း ဢွၵ်ႇမႃးတီႈ ၵွၵ်းႁူဝ်မၼ်း ဝႆးဝႆးသေ ဢဝ်ၶိူင်ႈသၼ်ႇဝႆ ဢၼ်ပႃးၼမ်ႉၶႅင် (HM-650 V၊ Thermo Fisher Scientific၊ CO2) ထၢတ်ႈ Ca2 + ACSF ဢေႇ (NaCl 125.0 mM၊ KCl 2.5 mM၊ ၼမ်ႉယႃႈယႃ သွတ်ႉတီႇယမ်ႇ ၽွတ်ႉၾႅတ်ႉ 1.25 mM၊ NaHCO3 25.0 mM၊ d-ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇ 25.0 mM၊ CaCl2 1.0 mM လႄႈ Adjust တေႃႇ pH370 6.0 mM ။ mOsm)။ ဢဝ် ၽွင်ဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ သူင်ႇၵႂႃႇတီႈ ႁွင်ႈဢၼ်ပႃး Ca2 + ACSF ၼမ်လိူဝ်ၼၼ်ႉ (NaCl 125.0 mM၊ KCl 2.5 mM၊ သွတ်ႉတီႇယမ်ႇၽွတ်ႉၾႅတ်ႉ 1.25 mM၊ လႄႈ 310 တေႃႇ 320 mOsm) ၼႆယဝ်ႉ။ သိမ်းဝႆႉ ၽိုၼ်လိၵ်ႈ 20 တေႃႇ 30 မိၼိတ်ႉ ၼင်ႇႁိုဝ် တေၸၢင်ႊၶိုၼ်းမႄးလႆႈ ၵွၼ်ႇပႆႇမၢႆတွင်း။
ၵၢၼ်မၢႆတွင်း။ ၶဵင်ႇမၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်လဵၵ်ႉ ဢၼ်ပႃးႁွင်ႈမၢႆတွင်းဢၼ်မၼ်ႈၵိုမ်းလႄႈ မၢၼ်ႇတူၺ်းဢၼ်ၸူမ်ၼမ်ႉ 20x (Scientifica) ၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်းတႃႇမၢႆတွင်းၵူႈလွင်ႈလွင်ႈယဝ်ႉ။ သႄးလ် Purkinje ဢၼ်ထၢင်ႇထိူမ်ဝႆႉၼၼ်ႉ လႆႈမၵ်းမၼ်ႈဝႆႉၸွမ်း (i) တၢင်းယႂ်ႇတူဝ်ၶိင်း၊ (ii) တီႈယူႇၶၢၼ်ႇထႃႇၶွင် ဢွၵ်းဢေႃဢွၼ်ႇ လႄႈ (iii) လွင်ႈၼႄဢွၵ်ႇ ၸိူဝ်ႉၽၼ်းၽူႈတၢင်ႇၶၢဝ်ႇ mtYFP ဢၼ်မီးသၢႆလႅင်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၽႅၼ်ႇပႅတ်ႉ ဢၼ်မီး ႁႅင်းၶၢမ်ႇ တီႈၸဵင်ႇမၼ်း 5 တေႃႇ 11 မႄႇၵူဝ်ႇႁမ်ႇၼၼ်ႉ ဢဝ် ၵႅဝ်ႈ ပရူဝ်ႇသီႇလီႇၵႅတ်ႉ (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, ၶိူင်ႈၶူဝ်း ပၢႆးသၢႆႊ၊ လွင်ႈမၢႆတွင်းတင်းမူတ်းၼႆႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈသဵင်ယႂ်ႇ ELC-03XS npi patch clamp (npi ဢီႇလႅတ်ႇထရွၵ်ႉ GmbH၊ တမ်ႇ၊ မိူင်းၵျႃႇမၼီႇ) ဢၼ်ဢဝ် ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ Signal (ဝႅပ်ႇယၢင်ႇ 6.0၊ ဢီႇလႅတ်ႇထရွၵ်ႉ ၶႅမ်ႇပရီႇ၊ ၶႅမ်ႇပရီႇ၊ မိူင်းယူႊၶေႊ) ၵုမ်းထိင်းဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်းၼႆႉ လႆႈမၢႆဝႆႉ တီႈ တၢင်းၼမ် 12.5 kHz ၼႆယဝ်ႉ။ သၢႆငၢႆၼၼ်ႉ ဢဝ်ၶိူင်ႈထတ်း Bessel ဢၼ်ပူၼ်ႉပွတ်း သွင်ဢၼ် ဢၼ်မီး သၢႆငၢႆ ဢၼ်တတ်းဢွၵ်ႇ 1.3 လႄႈ 10 kHz ၼၼ်ႉ ထတ်းတူၺ်း။ ၼမ်ႉၵတ်ႉ ၽိဝ်ၼင် လႄႈ ၽိဝ်ၼင် ၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် သၢႆသၢႆ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈသဵင်ယႂ်ႇၼၼ်ႉသေ သၢႆႈတႅၼ်းပၼ်။ လွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်းတင်းမူတ်းၼႆႉ လႆႈႁဵတ်းဝႆႉ ၽၢႆႇတႂ်ႈ လွင်ႈၵုမ်းၵမ် ၵွင်ႈထႆႇ Orca-Flash 4.0 (ႁႃႇမႃႇမတ်ႉသူႇ၊ ၵျႃႇတႅၼ်ႇ၊ ၵျႃႇမၼီႇ) ဢၼ်ဢဝ် ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ Hokawo (ပိူင် 2.8၊ ႁႃႇမႃႇမတ်ႉသူႇ၊ ၵျႃႇတႅၼ်ႇ၊ ၵျႃႇမၼီႇ) ၵုမ်းၵမ်ဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
လွင်ႈၶွတ်ႇၽွတ်ႈ လႄႈ လွင်ႈထတ်းသၢင် တင်းသႄးလ် ၸွမ်းၼင်ႇၵူႊပွၵ်ႈ။ ၵွၼ်ႇပႆႇမၢႆတွင်းၼၼ်ႉ ဢဝ်ၼမ်ႉယႃႈယႃ ဢၼ်ပႃးထၢတ်ႈ 4.0 mM KCl ၊ NaCl 2.0 mM ၊ EGTA 0.2 mM ၊ (Na) လႄႈ ၶရီးယႅတ်ႉတိၼ်ႇၼိၼ်ႇ ၽွတ်ႉၾႅတ်ႉ 10.0 mM ၼၼ်ႉ လႆႈမႄးႁႂ်ႈ pH 7.25 သေ ႁႅင်းဢွၵ်းဢေႃ ဢၼ်မီး 290 mOsm (သၵရူဝ်ႇသ်) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးသေ ဢဝ်ႁႅင်း 0 pA သေ တႅၵ်ႇၽိဝ်ၼင်ယဝ်ႉ လႆႈတႅၵ်ႈတူၺ်း ၼမ်ႉၵတ်ႉၽိဝ်ၼင် ဢၼ်လိုဝ်ႈသဝ်းၼၼ်ႉၵမ်းလဵဝ်ယဝ်ႉ။ လွင်ႈႁႄႉၵင်ႈ ဢၼ်ၶဝ်ႈမႃးၼၼ်ႉ ဢဝ်ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်မီး -40, -30, -20, -10 pA သေ တႅၵ်ႈ။ တႅၵ်ႈတူၺ်း တၢင်းယႂ်ႇ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉသေ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ပၵ်းပိူင် Ohm သေ ၼပ်ႉသွၼ်ႇ လွင်ႈႁႄႉၵင်ႈ ဢၼ်ၶဝ်ႈမႃးၼၼ်ႉ။ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ဢၼ်ပဵၼ်မႃးႁင်းၵူၺ်းၼၼ်ႉ လႆႈမၢႆဝႆႉ ၼႂ်းၶိူင်ႈၵမ်ႉယၼ် ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 5 မိၼိတ်ႉသေ sPSC ၼၼ်ႉ လႆႈႁူႉႁၼ်သေ တႅၵ်ႈဝႆႉ ၼႂ်း Igor Pro (ပိူင် 32 7.01၊ WaveMetrics၊ ၼွင်ဢွတ်ႉသဝီႇၵူဝ်ႇ၊ ဢူဝ်ႇရီႇၵၼ်ႇ၊ မိူင်းဢမေႇရိၵၢၼ်ႇ) ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း လိၵ်ႈမၢႆတွင်း ဢၼ်ႁဵတ်းၵၢၼ် ႁင်းမၼ်း ၶိုင်ႈၼိုင်ႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ IV curve လႄႈ steady-state current ၼႆႉ ဢဝ် လွင်ႈၶွတ်ႇၽွတ်ႈ ပႅတ်ႉထီးရီးယႃး တီႈ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ၵၼ် (တႄႇတီႈ -110 mV) သေ ဢဝ်ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ၶိုၼ်ႈမႃး 5 mV ၶၵ်ႉတွၼ်ႈသေ တႅၵ်ႈ။ လွင်ႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ AP ၼႆႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ လူႉလႅဝ်ၼၼ်ႉသေ ၸၢမ်းတူၺ်းယဝ်ႉ။ ၶွတ်ႇၽွတ်ႈ သႄးလ် တီႈ -70 mV ၽွင်းမိူဝ်ႈ ၸႂ်ႉတိုဝ်း သၢႆၾႆးၾႃႉ ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ လူႉလႅဝ်ၼၼ်ႉ။ ႁႂ်ႈမႄးပၼ် တၢင်းယႂ်ႇၶၵ်ႉတွၼ်ႈ ၶိူင်ႈမၢႆ ၵူႈဢၼ်ဢၼ် ႁင်းၽႂ်ႁင်းမၼ်း (10 တေႃႇ 60 pA)။ ၼပ်ႉသွၼ်ႇ AP ဢၼ်သုင်သုတ်း လူၺ်ႈဢဝ်မိုဝ်းသေ ၼပ်ႉသွၼ်ႇ လွင်ႈသၢႆၸႂ် ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ AP သုင်သုတ်းၼၼ်ႉ။ AP threshold ၼႆႉ လႆႈထတ်းသၢင်တူၺ်း လူၺ်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶေႃႈထူၼ်ႈသွင် ဢၼ်ပဵၼ် သၢႆၸႂ် ဢၼ်ႁဵတ်းႁႂ်ႈ AP ဢၼ်လဵဝ် ဢမ်ႇၼၼ် လိူဝ်ၼၼ်ႉ ဢွၵ်ႇမႃးၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
လွင်ႈၶွတ်ႇၽွတ်ႈ လႄႈ လွင်ႈထတ်းသၢင် ၽႅၼ်ႇႁူး။ ႁဵတ်းၵၢၼ်မၢႆတွင်း ပႅတ်ႉၸ် ဢၼ်မီးႁူး လူၺ်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ပိူင်ၵၢၼ် ဢၼ်ပဵၼ်ပိူင်တၢႆ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ပိပ်ႉဢၼ်ဢမ်ႇပႃး ATP- လႄႈ GTP ဢၼ်ဢမ်ႇပႃး ၶူဝ်းၶွင် ဢၼ်ပဵၼ် ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇၼႅတ်ႉ K 128 mM ၊ ATP လႄႈ GTP ၼႆႉ လႆႈဢဝ်ဢွၵ်ႇပႅတ်ႈ တီႈၼႂ်း ၼမ်ႉယႃႈယႃ ၼႂ်းသႄး တႃႇႁႄႉၵင်ႈ လွင်ႈၸိုမ်းၶဝ်ႈ ဢၼ်ဢမ်ႇၵုမ်းထိင်းလႆႈ တီႈၽီႉသႄးၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼႂ်းၽႅၼ်ႇပႅတ်ႉၼၼ်ႉ ဢဝ်ၼမ်ႉယႃႈယႃ ဢၼ်ပႃး ဢႅမ်ႇၾူဝ်ႇတႄႇရီႇသိၼ်ႇ (မွၵ်ႈ 200 တေႃႇ 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ၼၼ်ႉ တဵမ်ဝႆႉ တႃႇတေလႆႈ မၢႆတွင်း ၽႅၼ်ႇဢၼ်ႁူးဝႆႉၼၼ်ႉ။ ဢႅမ်ႇၾူဝ်ႇတႄႇရီႇသိၼ်ႇၼႆႉ ဢဝ်ယွမ်ႉသႂ်ႇၼႂ်း တီႇမီႇတႄႇ သႃႇလ်ၾူဝ်ႇဢွၵ်ႉသၢႆႉ (လွင်ႈၶွၼ်ႈတုမ် ၵမ်းလိုၼ်းသုတ်း 0.1 တေႃႇထိုင် 0.3%၊ DMSO၊ D8418၊ သိၵ်ႊမႃႇ-ဢႄးလ်တရိတ်ႉ) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၶွၼ်ႈတုမ် DMSO ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်းၼၼ်ႉ ဢမ်ႇမီးလွင်ႈတုမ်ႉယွၼ်ႈဢၼ်ထၢင်ႇၸႅင်ႈၼိူဝ် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇဢၼ်လႆႈလဵပ်ႈႁဵၼ်းဝႆႉၼၼ်ႉ။ ၽွင်းမိူဝ်ႈ ႁဵတ်းၵၢၼ် ပၼ်ႇႁွပ်ႈၼၼ်ႉ လႆႈပႂ်ႉတူၺ်း လွင်ႈၶၢမ်ႇသၢႆ (Ra) ၼၼ်ႉ ဢမ်ႇထၢတ်ႇဢမ်ႇဝၢႆးသေ ဝၢႆးသေ သၢႆႁိူဝ်ႈလႅင်း Ra လႄႈ AP ၼိမ်သဝ်းယဝ်ႉ (20-40 မိၼိတ်ႉ) ၸင်ႇတႄႇၸၢမ်းတူၺ်းယဝ်ႉ။ လွင်ႈတူင်ႉၼိုင် ဢၼ်ပဵၼ်မႃးႁင်းၵူၺ်းၼၼ်ႉ ဢဝ်ၶိူင်ႈတႅၵ်ႈ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ လႄႈ/ဢမ်ႇၼၼ် ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 2 တေႃႇ 5 မိၼိတ်ႉ။ ၵၢၼ်ထတ်းသၢင်ၶေႃႈမုၼ်းၼႆႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း Igor Pro (ပိူင် 7.05.2၊ WaveMetrics၊ မိူင်းဢမေႇရိၵၢၼ်ႇ)၊ မိူင်းဢမေႇရိၵၢၼ်ႇ)။ ၼင်ႇႁိုဝ် တေႁူႉလႆႈ AP ဢၼ်ပဵၼ်မႃးႁင်းၵူၺ်းၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ပလၵ်ႉဢိၼ်ႇ NeuroMatic v3.0c ၶွင် IgorPro ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း threshold ဢၼ်ပၼ်ဝႆႉၼၼ်ႉသေ ၸႅၵ်ႇၽႄ APs လူၺ်ႈလၢႆးဢွမ်လူမ်း ဢၼ်လႆႈမႄးၵုမ်း ၽႂ်မၼ်း တွၼ်ႈတႃႇ မၢႆတွင်းၵူႈဢၼ်ဢၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၵႄႈၵၢင် လွင်ႈၶိုၼ်ႈသုင်သေ တႅပ်းတတ်း လွင်ႈၶိုၼ်ႈသုင် ဢၼ်မီး လွင်ႈၶိုၼ်ႈသုင် ၵမ်းလဵဝ် ဢၼ်သုင်သုတ်း လႄႈ လွင်ႈၶိုၼ်ႈသုင် ၽတ်ႉၽဵင်ႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
PN ႁင်းၶေႃ။ လူၺ်ႈလွင်ႈမူၼ်ႉမႄးၸွမ်း ပိူင်ၵၢၼ်ဢၼ်ပိုၼ်ၽႄဢွၵ်ႇမႃးမိူဝ်ႈဢွၼ်တၢင်းၼၼ်ႉသေ PNs ၼႆႉ လႆႈထုၵ်ႇႁဵတ်းႁႂ်ႈမူတ်းသႂ် တီႈဢွၵ်းဢေႃၼူ တီႈၸၼ်ႉဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ (58) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼႂ်းၵႅပ်ႈမၼ်း ဢွၵ်းဢေႃဢွၼ်ႇၼၼ်ႉ လႆႈၶူၼ်းၶဝ်းသေ ၶူၼ်းသႂ်ႇၼႂ်း ၼမ်ႉၶႅင် ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇ [ဢမ်ႇပႃး HBSS Ca2+ လႄႈ Mg2+ သေ ဢဝ်ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇ 20 mM ၊ / မီႇလီႇလီႇတႃႇ)၊ ဢွၼ်တၢင်းသုတ်း သုၵ်ႈပၼ် တိတ်ႉသျိဝ်း ၼႂ်းၼမ်ႉယႃႈယႃ HBSS ဢၼ်ပႃး ၼမ်ႉၼူမ်းၶႆႇ (10 mg/ml)၊ (0.05 မီႇၵရီႇ/မီႇလီႇလီႇ) လႄႈ DNase (0.1 မီႇၵရီႇ/မီႇလီႇ) ၸိူဝ်းၼႆႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ သႄးလ် ဢၼ်လဵဝ်ဢွၵ်ႇမႃး။ ၼမ်ႉယၢင်သႄးလ် ဢၼ်လႆႈမႃးၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈသႄးလ် ဢၼ်မီး 70μm ၼၼ်ႉ ၶူၼ်းၶဝ်းလေႃးၵၼ်သေ ဢဝ်သႄးလ် ၸိူဝ်းၼၼ်ႉ ၶူၼ်းၶဝ်းလေႃးၵၼ် လူၺ်ႈ လွင်ႈၶူၼ်းၶဝ်း (1110 rpm, 5 မိၼိတ်ႉ၊ 4°C) သေ ၶိုၼ်းယွမ်ႉသီဝႆႉ ၼႂ်းၶိူင်ႈၸႅၵ်ႇၽႄ [HBSS, ဢၼ်ၽိူမ်ႉထႅမ်ပၼ် ၵလူဝ်ႇၵူဝ်ႇ 20 mM၊ (0.05 မီႇၵရီႇ/မီႇလီႇ)]၊ ထတ်းသၢင်တူၺ်း လွင်ႈယူႇသဝ်း သႄးလ် လူၺ်ႈ ပရူဝ်ႇပီႇတီႇယမ်ႇ ဢၢႆႇဢူဝ်ႇတၢႆႉသေ မူၼ်ႉမႄး တၢင်းၼႅၼ်ႈၼႃ သႄးလ် ႁႂ်ႈပဵၼ် 1×106 တေႃႇထိုင် 2×106 သႄးလ်/ml ။ ၵွၼ်ႇပႆႇႁဵတ်း flow cytometry ၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် ၼမ်ႉယၢင် ဢၼ်ယွမ်ႉသီဝႆႉၼၼ်ႉ လတ်းၽၢၼ်ႇ ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ သႄးလ် ဢၼ်မီး 50 μm ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ၶိူင်ႈတႅၵ်ႈ ၼမ်ႉလႆ။ လွင်ႈၸႅၵ်ႇၽႄ သႄးလ်ၼႆႉ လႆႈႁဵတ်းဝႆႉ တီႈ 4°C လူၺ်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ FACSAria III (BD ပၢႆးသၢႆႊတူဝ်ၸႂ်) လႄႈ ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ FACSDiva (BD ပၢႆးသၢႆႊတူဝ်မီးၸႂ်၊ ပိူင် 8.0.1) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈဢၼ် သႄးလ် ႁွႆႈဝႆႉၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ႁူးၼမ်ႉ 100 μm ဢၼ်မီး ႁႅင်းတဵၵ်း 20 psi ဢၼ်မီး တၢင်းဝႆး ~2800 events/sec ၼၼ်ႉသေ ၸႅၵ်ႇၽႄဝႆႉယဝ်ႉ။ ယွၼ်ႉဝႃႈ ပိူင်တႅၵ်ႈ ၽၵ်းတူ ၽိင်ႈထုင်း (တၢင်းယႂ်ႇသႄး၊ လွင်ႈၸႅၵ်ႇၽႄ သွင်ပိူင် လႄႈ ၽၢင်ႁၢင်ႊ ဢၼ်ၽႄႈၸွတ်ႇ) ၼႆႉ ဢမ်ႇၸၢင်ႊ မၼ်ႈၸႂ်လႆႈ လွင်ႈၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇ PN ဢၼ်မၢၼ်ႇမႅၼ်ႈ တီႈ မဵဝ်းသႅၼ်း သႄး တၢင်ႇၸိူဝ်းၼၼ်ႉလႄႈ လွၵ်းလၢႆး ၽၵ်းတူၼႆႉ လႆႈဢိင်ၼိူဝ် လွင်ႈတႅၵ်ႈၼိူင်း ၵမ်းသိုဝ်ႈ ၶွင် ႁႅင်း YFP လႄႈ လွင်ႈလႅင်းႁိူဝ်ႈ ၼႂ်း mitoYFP+ ​​လႄႈ လွင်ႈၵုမ်းထိင်း MitoYFP − ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ YFP ၼႆႉ မၼ်းလႆႈထုၵ်ႇ ဢဝ်သၢႆလႅတ်ႇသိူဝ်ႇ 488 nm သေ ဢဝ်သၢႆလႅတ်ႇသိူဝ်ႇ 488 nm သေ ႁႃႁၼ် သၢႆငၢႆၼၼ်ႉ လူၺ်ႈ ၶိူင်ႈထတ်း band pass 530/30 nm ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈၼူ mitoYFP+ ​​ၼၼ်ႉ၊ ဢဵၼ်ႁႅင်းဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်ၶွင် ပီႇၸႃႉၽူႈတၢင်ႇၶၢဝ်ႇ Rosa26-mitoYFP ၼၼ်ႉၵေႃႈၸ်ႂႉတိုဝ်းတွၼ်ႈတႃႇတေ ၸႅၵ်ႇၽႄဢွၵ်ႇ တူဝ်ၶိင်းဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇလႄႈ ပွတ်းတွၼ်ႈၶွင် axon ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ 7-AAD ၼႆႉ ဢဝ်လႅတ်ႇသိူဝ်ႇသီလိူင် 561 nm သေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈၸႂ်လမ်သေ ဢဝ်ၶိူင်ႈထတ်း bandpass 675/20 nm သေ ၸႅတ်ႈတူၺ်း တႃႇတေထွၼ်ဢွၵ်ႇ သႄးလ်ဢၼ်တၢႆၵႂႃႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼင်ႇႁိုဝ် တေၸႅၵ်ႇၽႄလႆႈ သႄးလ် (astrocytes) မိူဝ်ႈလဵဝ်ၵၼ်ၼၼ်ႉ ဢဝ် ACSA-2-APC သေ ဢဝ်သၢႆလႅတ်ႇသိူဝ်ႇ 640 nm သေ ဢဝ်သၢႆလႅတ်ႇသိူဝ်ႇ 640 nm သေ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈထတ်း bandpass 660/20 nm သေ ၸႅတ်ႈတူၺ်း သၢႆငၢႆၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
သႄးဢၼ်ၵဵပ်းႁွမ်ဝႆႉၼၼ်ႉ ဢဝ်လွင်ႈႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ်မၢၵ်ႇ (1110 rpm, 5 မိၼိတ်ႉ၊ 4°C) သေ သိမ်းဝႆႉတီႈ -80°C တေႃႇထိုင်ပေႃးၸႂ်ႉတိုဝ်းလႆႈယဝ်ႉ။ ၼူ Mfn2cKO လႄႈ လုၵ်ႈၼူၶဝ်ၼၼ်ႉ လႆႈၸႅၵ်ႇၽႄဝႆႉ ၼႂ်းဝၼ်းလဵဝ်ၵၼ် ၼင်ႇႁိုဝ် လွင်ႈလႅၵ်ႈလၢႆႈ လၢႆးႁဵတ်းလၢႆးသၢင်ႈ တေဢေႇသုတ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵၢၼ်ၼႄၶေႃႈမုၼ်း FACS လႄႈ ၵၢၼ်ထတ်းသၢင်ၼႆႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ FlowJo (FlowJo LLC, ဢႅတ်ႉလႅၼ်ႇ၊ ဢူဝ်ႇရီႇၵၼ်ႇ၊ မိူင်းဢမေႇရိၵၢၼ်ႇ) သေ ႁဵတ်းသၢင်ႈမႃးယဝ်ႉ။
မိူၼ်ၼင်ႇလၢတ်ႈမႃးပႃႈၼိူဝ် (59) ၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း PCR ၶၢဝ်းယၢမ်းတႄႉတႄႉ တႃႇၸႅၵ်ႇဢွၵ်ႇ DNA တီႈၼႂ်း ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ၸႅၵ်ႇဝႆႉ တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ mtDNA ဝၢႆးလင်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈပဵၼ်သဵၼ်ႈသၢႆ လႄႈ လွင်ႈႁူႉႁၼ် ဢၼ်မီးတီႈသုင်သုတ်းၼၼ်ႉ လႆႈၸၢမ်းတူၺ်း လူၺ်ႈ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ် qPCR ၼိူဝ် သႄးလ် ဢၼ်မီး တၢင်းၼမ် ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ၵၼ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပေႃးလၢတ်ႈၵႂၢင်ႈၵႂၢင်ႈၶႂၢင်ၶႂၢင်ၸိုင် ဢဝ် PN 300 မႃးသႂ်ႇၼႂ်း ၼမ်ႉယၢင် ဢၼ်ပႃး ထၢတ်ႈ tris-HCl 50 mM (pH 8.5)၊ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈထတ်းသၢင် TaqMan (Thermo Fisher) ဢၼ်ပဵၼ် mt-Nd1 ၼၼ်ႉသေ တႅၵ်ႈ mtDNA လူၺ်ႈ PCR ဢၼ်မီး တၢင်းၼမ် ၶိုင်ႈၼိုင်ႈ ၼႂ်းပိူင် 7900HT Real-Time Ficientisher SPCR system (Thermosher) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပၢႆးသၢႆႊ၊ မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ Mm04225274_s1)၊ mt-Nd6 (ပၢႆးသၢႆႊ ၽၢႆႇထၢတ်ႈမႆႈ၊ မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ AIVI3E8) လႄႈ 18S (ပၢႆးသၢႆႊ ၽၢႆႇထၢတ်ႈမႆႈ၊ မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ Hs99999901_s1) ၸိူဝ်းၼႆႉယဝ်ႉ။
လွင်ႈႁၢင်ႈႁႅၼ်းတူဝ်ယၢင်ႇ ပရူဝ်ႇတိၼ်း။ လူၺ်ႈလွင်ႈဢဝ်ၼမ်ႉယၢင်ၼၼ်ႉ မႆႈတီႈ 95°C တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 10 မိၼိတ်ႉသေ ႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ်သဵင် ၼႂ်းၼမ်ႉယၢင် ဢၼ်ယွမ်ႉသီဝႆႉ [6 M ၵူဝ်ႇၼီႇတိၼ်ႇၶလူဝ်ႇရၢႆႉ၊ 10 mM ထရိတ်ႉ(2-carboxyethyl) ၽွတ်ႉၾိၼ်ႇႁၢႆႇထရူဝ်ႇၶရူဝ်ႇရၢႆႉ၊ 10 mM ၶရူဝ်ႇရူဝ်ႇဢႅတ်ႉသိတ်ႉတမ်ႇမၢႆႉ လႄႈ 100 mM ထရိတ်ႉ-HC ပႄႇလီႇ ၼႂ်းဢဵၼ်ႁႅင်းၶႅင်] ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၼိူဝ် Bioruptor (Diagenode) တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 10 မိၼိတ်ႉ (ၶၢဝ်းယၢမ်း 30 ၸူဝ်ႈမူင်း / ၶၢဝ်းယၢမ်းၵိုတ်းယင်ႉ 30 ၸူဝ်ႈမူင်း)။ တူဝ်ယင်ႇၼၼ်ႉ ဢဝ် tris-HCl 20 mM (pH 8.0) မႃးလေႃးၵၼ် 1:10 သေ ဢဝ်ၶမ်း trypsin (Promega) 300 ng မႃးလေႃးၵၼ်သေ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈဝႆႉ ၶိုၼ်းၼိုင်ႈ တီႈ 37°C ႁႂ်ႈလႆႈ လွင်ႈယႃႉၵဝ်း ႁႂ်ႈတဵမ်ထူၼ်ႈ။ ဝၼ်းတီႈသွင် ဢဝ်တူဝ်ယၢင်ႇၼၼ်ႉ ဢဝ် 20,000 ၵရမ်ႇ မႃးၽူတ်ႉ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 20 မိၼိတ်ႉ။ ၼမ်ႉဢၼ်လႆၼိူဝ်မၼ်းၼၼ်ႉ ဢဝ်ၾူမ်းဢႅတ်ႉသိတ်ႉ 0.1% သေ ဢဝ် StageTips ဢၼ်ႁဵတ်းႁင်းၵူၺ်းၼၼ်ႉ ဢဝ်ၵိူဝ်ဢွၵ်ႇပႅတ်ႈ။ တူဝ်ယင်ႇၼၼ်ႉ ဢဝ်ႁႅင်ႈဝႆႉ ၼႂ်းၶိူင်ႈ SpeedVac (ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ Eppendorf ႁူမ်ႈ 5305) တီႈ 45°C သေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ဢဝ်ပႅပ်ႉတၢႆႉၼၼ်ႉ ႁေႈဝႆႉ ၼႂ်းဢႅတ်ႉသိတ်ႉၾူမ်း 0.1% ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တူဝ်ယၢင်ႇတင်းမူတ်းၼႆႉ ပဵၼ်ၵူၼ်းၵေႃႉလဵဝ်ၵၼ် ႁၢင်ႈႁႅၼ်းဝႆႉ မိူဝ်ႈလဵဝ်ၵၼ်။ တႃႇတေထတ်းသၢင်တူၺ်း တူဝ်ယင်ႇ သႄးလၢဝ်(astrocyte) ၼၼ်ႉ ပႅပ်ႉတၢႆႉဢၼ်ဢမ်ႇမီးၵိူဝ် 4 μg ၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ်ပၢႆႉၼမ်ႉၼၵ်းဢၼ်မိူၼ်ၵၼ် (TMT10plex၊ မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ 90110၊ Thermo Fisher Scientific) ဢၼ်မီး တၢင်းၼမ်ဢေႇ ပႅပ်ႉတၢႆႉတေႃႇ ၶိူင်ႈထၢတ်ႈ TMT ဢၼ်မီး 1:20 ၼၼ်ႉ တၢင်ႇဝႆႉယဝ်ႉ။ တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈတၢင်ႇမၢႆ TMT ၼၼ်ႉ ၶိူင်ႈထၢတ်ႈ TMT 0.8 mg ၼၼ်ႉ ၶိုၼ်းဢဝ် ACN ဢၼ်ဢမ်ႇမီးၼမ်ႉ 70 μl ၼၼ်ႉ ၶိုၼ်းယွမ်ႉသႂ်ႇသေ ဢဝ် peptide ဢၼ်ႁႅင်ႈဝႆႉၼၼ်ႉ ၶိုၼ်းႁဵတ်းႁႂ်ႈပဵၼ် 9 μl ၶွင် TEAB 0.1 M (triethylammonium bicarbonate) သေ ဢဝ်ၶိူင်ႈထၢတ်ႈ TMT ဢၼ်မီးၼႂ်း ACN ၼၼ်ႉ 7 μl မႃးသႂ်ႇထႅင်ႈယဝ်ႉ။ လွင်ႈၶွၼ်ႈတုမ် မီး 43.75% ၼႆယဝ်ႉ။ ဝၢႆးသေ ၽုၵ်ႇသွမ်ႈ 60 မိၼိတ်ႉယဝ်ႉ ဢဝ် ႁၢႆႇထရူဝ်ႇၵျီႇလႃႇမိၼ်ႇ 5% 2 μl သေ ႁၢမ်ႈတၢပ်ႈ လွင်ႈတုမ်ႉတွပ်ႇၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢဝ် peptides ဢၼ်မီးပၢႆႉဝႆႉၼၼ်ႉ ၵဵပ်းႁွမ်သေ ႁႅင်ႈသေ ၶိုၼ်းယွမ်ႉသႂ်ႇၼႂ်း 200μl ၶွင် 0.1% formic acid (FA) သေ ၸႅၵ်ႇပဵၼ်သွင်ဢၼ်သေ ဝၢႆးၼၼ်ႉ ဢဝ် StageTips ဢၼ်ႁဵတ်းႁင်းၵူၺ်းၼၼ်ႉ ဢဝ်ၵိူဝ်ဢွၵ်ႇပႅတ်ႈယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈထတ်းသီၼမ်ႉ ဢၼ်ႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈလီလိူဝ်ပိူၼ်ႈ ဢၼ်ပဵၼ် UltiMate 3000 ၼၼ်ႉသေ ၼႂ်းသွင်ၶိုင်ႈၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် ၶိုင်ႈၼိုင်ႈ ၽႄဢွၵ်ႇ ၼိူဝ် သဝ်ၶရူဝ်ႇမႃႇထူဝ်ႇၵရႅပ်ႉ Acquity ဢၼ်မီး 1mm x 150mm ဢၼ်ပႃး ၽုၼ်ႇထၢတ်ႈ C18 130Å1.7μm ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ သႃႇမူဝ်ႇၾိတ်ႉသျႃး ပၢႆးသၢႆႊ)။ ၽႄဢွၵ်ႇ ပႅပ်ႉတၢႆႉ ဢၼ်မီး တၢင်းလႆ 30μl/min သေ ၽႄဢွၵ်ႇ 1% တေႃႇထိုင် 50% ၶွင် ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ် B တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 85 မိၼိတ်ႉ လူၺ်ႈ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ 96 မိၼိတ်ႉ လုၵ်ႉတီႈ 50% တေႃႇထိုင် 95% ၶွင် ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ် B တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 3 မိၼိတ်ႉ ယဝ်ႉၵေႃႈ 8 မိၼိတ်ႉ တႃႇ 95 % ၶွင် ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ် B ၊ ၼမ်ႉယႃႈယႃ A ၼႆႉ ပဵၼ် ACN 5% လႄႈ ဢႃႇမွၼ်ႇၼိမ်ႇ ပၢႆႇၵႃႇပုၼ်ႇၼႅတ်ႉ (ABC) 10 mM သေ ၼမ်ႉယႃႈယႃ B သမ်ႉ ပဵၼ် ACN 80% လႄႈ ABC 10 mM ၼႆယဝ်ႉ။ ၵဵပ်းဢဝ် ၽွင်ပွတ်း ၵူႈ 3 မိၼိတ်ႉသေ ဢဝ်မႃးႁူမ်ႈၵၼ် ပဵၼ်သွင်ၸုမ်း (1 + 17, 2 + 18 ၸႃႉၵႂႃႇ) သေ ႁႂ်ႈႁႅင်ႈၼႂ်း ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ ဢၼ်ႁႅင်ႈ ႁႅင်ႈ။
ၵၢၼ်ထတ်းသၢင် LC-MS/MS ။ တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈထတ်းသၢင် သၢႆလႅင်း ဢၼ်မီး ၼမ်ႉၼၵ်း ၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ် ပႅပ်ႉတၢႆႉ (မၢႆ r119.aq) ၼၼ်ႉ ၽၢတ်ႇဢွၵ်ႇဝႆႉ ၼိူဝ် သဝ်ထတ်းသၢင် PicoFrit ဢၼ်မီး သဵၼ်ႈတၢင်းတၢင်းၼႂ်း 25 cm၊ EASY-nLC 1200 (ထႃႇမူဝ်ႇၾိတ်ႉသျႃးပၢႆးသၢႆႊ မိူင်းၵျႃႇမၼီႇ)။ သဝ်ၼၼ်ႉ လႆႈဝႆႉတီႈ 50°C ။ ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ် A လႄႈ B ၼႆႉ ပဵၼ် ဢႅတ်ႉသိတ်ႉ ၾူမ်း 0.1% ၼႂ်းၼမ်ႉ လႄႈ ၾူမ်းဢႅတ်ႉသိတ်ႉ 0.1% ၼႂ်း ACN 80% ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဢဝ် Peptides သေ ၽၢတ်ႇဢွၵ်ႇ လူၺ်ႈ ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ 200 nl/min ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ 6% တေႃႇထိုင် 31% ၶွင် ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ် B တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 65 မိၼိတ်ႉ လႄႈ လုၵ်ႉတီႈ 31% တေႃႇထိုင် 50% ၶွင် ၶိူင်ႈၵမ်ႉၵႅမ် B တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 5 မိၼိတ်ႉ။ ပႅပ်ႉတၢႆႉဢၼ်လႆႈထုၵ်ႇယႃႉပႅတ်ႈၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇထတ်းသၢင်တူၺ်းၼိူဝ် ၶိူင်ႈထတ်းသၢင်သၢႆလႅင်းဢၼ်ႁူမ်ႈၵၼ်ဝႆႉ ဢၼ်ပဵၼ် Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈတႅၵ်ႈ m/z ဢၼ်ပဵၼ် ပႅပ်ႉတၢႆႉ ဢၼ်ပဵၼ် ဢွၼ်တၢင်းသုတ်းၼၼ်ႉ ႁဵတ်းၸွမ်း လွင်ႈၶႅမ်ႉလႅပ်ႈ 120,000 ၼႂ်းၵႄႈ 350 တေႃႇထိုင် 1500 m/z ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ႁႅင်းၽႃႇၺႃးၵၼ် ဢၼ်ပဵၼ်ၸွမ်းပိူင်မၼ်း 27% ၼၼ်ႉသေ ၶိူင်ႈဢၼ်ႁႅင်းလိူဝ်ပိူၼ်ႈ ဢၼ်မီး သၢႆငၢႆ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ 2 တေႃႇထိုင် 6 ၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇလိူၵ်ႈဝႆႉ တႃႇ လွင်ႈတႅၵ်ႇယၢႆႈ C trap dissociation (HCD) ဢၼ်မီးႁႅင်းသုင်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶၢဝ်းယၢမ်း ပၼ်ႇႁွပ်ႈ မၼ်းတမ်းဝႆႉ 1 s ။ ၵႃႈၶၼ် m/z ၶွင် ပွတ်းတွၼ်ႈ ပႅပ်ႉတၢႆႉၼၼ်ႉ လႆႈတႅၵ်ႈတူၺ်း ၼႂ်းၽႅၼ်ႇဢၢႆႇယွၼ်ႇ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း AGC ဢၼ်လဵၵ်ႉသုတ်း 5×104 လႄႈ ၶၢဝ်းယၢမ်း သမ်းယႃႈယႃ ဢၼ်သုင်သုတ်း 86 ms ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ဝၢႆးသေ လွင်ႈတႅၵ်ႇယၢႆႈယဝ်ႉ ၶူဝ်းၶွင်ဢၼ်တေမႃးဢွၼ်တၢင်းၼၼ်ႉ လႆႈဢဝ်ဝႆႉၼႂ်းသဵၼ်ႈမၢႆ ဢၼ်ဢမ်ႇပႃးဢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႈ တႃႇၶၢဝ်းတၢင်း 45 s ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ပႅပ်ႉတၢႆႉ ဢၼ်မီးပၢႆႉ TMT ၼၼ်ႉ လႆႈၽၢတ်ႇဢွၵ်ႇဝႆႉ တီႈၼိူဝ် သဝ် Acclaim PepMap ဢၼ်မီး 50 cm၊ 75 μm (Thermo Fisher Scientific၊ မၢႆသဵၼ်ႈမၢႆ 164942) လႄႈ သၢႆလႅင်းဢၼ်ၶၢႆႉတီႈၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇထတ်းၸႅတ်ႈတူၺ်း ၼိူဝ် ၶိူင်ႈထတ်းသၢႆလႅင်း Orbitrap Lumos Tribrid ဢၼ်ပဵၼ် ႁၢင်ႈၽၢင် သၢႆလႅင်း ဢၼ်မီး ႁႅင်းထၢတ်ႈမႆႈၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶိူင်ႈၸႂ်ႉတိုဝ်း (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) ၼႆႉ ႁဵတ်းၵၢၼ်တီႈ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ ဢၼ်သၢႆႈတႅၼ်းပၼ် သွင်ဢၼ် ဢၼ်ပဵၼ် −50 လႄႈ −70 V ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈၽႄဢွၵ်ႇ ပႅပ်ႉတၢႆႉၼႆႉ လႆႈႁဵတ်းၼိူဝ် EASY-nLC 1200 သေ ၸႂ်ႉတိုဝ်း လၢႆးယွမ်ႉသီ ဢၼ်မီး 90% ဢၼ်မီး ၼမ်ႉၼၵ်း 6% တေႃႇထိုင် 31% ၊ ၼမ်ႉယႃႈယႃ A ၼႆႉ ပဵၼ် 0.1% FA သေ ၼမ်ႉယႃႈယႃ B သမ်ႉ ပဵၼ် 0.1% FA လႄႈ 80% ACN ၼႆယဝ်ႉ။ ၶွပ်ႇထတ်းသၢင်ၼႆႉ ႁဵတ်းၵၢၼ်တီႈ 50°C ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း FreeStyle (ဝႅပ်ႇယၢင်ႇ 1.6, ထႄႇရူဝ်ႇၾိတ်ႉသျႃးပၢႆးသၢႆႊ) သေ ၸႅၵ်ႇၽႄ ၾၢႆႇငဝ်ႈမၼ်း ၸွမ်းၼင်ႇ ႁႅင်းၾႆးၾႃႉ FAIMS ဢၼ်သၢႆႈတႅၼ်းပၼ်ၼၼ်ႉ။
လွင်ႈႁူႉႁၼ် ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း လႄႈ လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈသွၵ်ႈႁႃ ဢႅၼ်ႇတရူဝ်ႇမီႇတႃႇ ဢၼ်ႁူမ်ႈႁွမ်းၵၼ်ဝႆႉၼၼ်ႉသေ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်ပဵၼ် ငဝ်ႈငႃႇမၼ်းၼၼ်ႉသေ ထတ်းသၢင်တူၺ်း ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်ပဵၼ် မႅၵ်ႉသ်ၶျွၼ်ႇ ဝႅပ်ႇယၢင်ႇ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လိူဝ်သေၼၼ်ႉ ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ Cre recombinase လႄႈ YFP ဢၼ်လႆႈမႃးတီႈ Aequorea victoria ၼၼ်ႉယဝ်ႉ၊ သၢႆႁိူဝ်ႈလႅင်းပွတ်းတွၼ်ႈၶွင် peptide ၼၼ်ႉလႆႈသွၵ်ႈႁႃတွၼ်ႈတႃႇ ၶၵ်ႉတွၼ်ႈဢၼ်မႅၼ်ႈၸွမ်းပၵ်းပိူင်လႄႈ ၶၵ်ႉတွၼ်ႈဢၼ်မိူၼ်ၵၼ်ၶွင် ပရူဝ်ႇတိၼ်းဢၼ်ပဵၼ်ၽိုၼ်ဢိင်ၶွင် ၼူ(ပရူဝ်ႇတိၼ်း ID UP000000589၊ ဢၼ်လႆႈလူင်းမႃးတီႈ UniProt မိူဝ်ႈလိူၼ် May20 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ လွင်ႈဢွၵ်ႇသီႇၵျိၼ်ႇ မီႇထီႇယွၼ်ႇၼိၼ်ႇ လႄႈ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း N-terminal acetylation ၼၼ်ႉ လႆႈတမ်းဝၢင်းဝႆႉ ႁႂ်ႈပဵၼ် လွင်ႈမူၼ်ႉမႄး ဢၼ်ၸၢင်ႊလႅၵ်ႈလၢႆႊလႆႈ၊ လွင်ႈမူၼ်ႉမႄး cysteine ​​carbamoyl ၼၼ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇတမ်းဝၢင်းဝႆႉ ႁႂ်ႈပဵၼ် လွင်ႈမူၼ်ႉမႄးဢၼ်မၼ်ႈၵိုမ်းၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၶေႃႈမၵ်းမၼ်ႈ လွင်ႈႁုင်ၶဝ်ႈၽၵ်းၼၼ်ႉ လႆႈတမ်းဝႆႉ “လွင်ႈတႅတ်ႈၼႅတ်ႈ” လႄႈ “ထရီႇပိၼ်ႇ/P” ၼႆယဝ်ႉ။ ပႅပ်ႉတၢႆႉ လႄႈ ပႅပ်ႉတၢႆႉ ရႅတ်ႉၸ် ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း တႃႇႁူႉႁၼ် ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်းၼၼ်ႉ တီႈဢေႇသုတ်းမၼ်း မီး 1 ဢၼ်၊ တၢင်းၼမ်ဢၼ်ဢေႇသုတ်းၶွင် peptides ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ၵၼ်ၼၼ်ႉ ပဵၼ် 0 ယဝ်ႉ။ ၽၢႆႇတႂ်ႈငဝ်းလၢႆးၶွင် ၽႅၼ်ႇလိၼ် peptide ဢၼ်ထုၵ်ႇမႅၼ်ႈၵၼ်ၼၼ်ႉ၊ တၢင်းၼမ်လွင်ႈမၵ်းမၼ်ႈထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်းၼၼ်ႉ ပဵၼ် 0.01 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ တီႈ “ပႅပ်ႉတၢႆႉ မၢႆသွင်” ၼၼ်ႉ မၼ်းပိုတ်ႇဝႆႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း “လွင်ႈမႅၼ်ႈၵၼ် ၼႂ်းၵႄႈ ၵၢၼ်လႅၼ်ႈ” တႃႇသူင်ႇပၼ် လွင်ႈမၵ်းမၼ်ႈ ဢၼ်ဢွင်ႇမၢၼ် ၼႂ်းၵႄႈ ၾၢႆႇငဝ်ႈတိုၼ်း ဢၼ်ဢမ်ႇမိူၼ်ၵၼ်ၼၼ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း LFQ တၢင်းၼမ်ဢေႇသုတ်း ၼပ်ႉ 1 တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈၼပ်ႉသွၼ်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇမီးပၢႆႉ (LFQ) (60)။ လွင်ႈႁႅင်း LFQ ၼႆႉလႆႈထုၵ်ႇထတ်းဢွၵ်ႇတွၼ်ႈတႃႇ ၵႃႊၶၼ်ဢၼ်မၢၼ်ႇမႅၼ်ႈတီႈဢေႇသုတ်းမၼ်းသွင်ဢၼ် တီႈဢေႇသုတ်းမၼ်း ၸုမ်း genotype ဢၼ်ၼိူင်ႈ တီႈၶၢဝ်းယၢမ်းၵူႈပွၵ်ႈၼၼ်ႉသေယဝ်ႉ လႆႈထုၵ်ႇထတ်းသၢင်ဢွၵ်ႇမႃးတီႈ လွင်ႈၽႄႈၸွတ်ႇဢၼ်ၽဵၼ်ႈၽဵၼ်ႈ ဢၼ်မီးတၢင်းၵႂၢင်ႈၶွင်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ 0.3 သေ ၶၢႆႉလူင်းၵႂႃႇ 1.8 ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ပိူင်ၶွမ်ႇပိဝ်ႇထႃႇ ပႃႇသျိတ်ႉ (https://maxquant.net/perseus/) လႄႈ R (https://r-project.org/) သေ ထတ်းသၢင်တူၺ်း ၶေႃႈတွပ်ႇ LFQ ၼၼ်ႉ။ လွင်ႈထတ်းသၢင် t ဢၼ်မီးသွင်ၽၢႆႇ ဢၼ်လုၵ်ႉတီႈ ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ limma ၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်းမႃး တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈၼႄလွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ (61) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၵၢၼ်ထတ်းသၢင်ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်ၶူၼ်ႉၶႂႃႉၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ggplot၊ ၶေႃႈမုၼ်း ပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် TMT ၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း MaxQuant ပိူင် 1.6.10.43 သေ ထတ်းသၢင်တူၺ်းယဝ်ႉ။ သွၵ်ႈႁႃၶေႃႈမုၼ်း ပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ဢမ်ႇပႆႇလႆႈ ႁဵတ်းၵၢၼ် တီႈၼႂ်း ၶေႃႈမုၼ်း ပရူဝ်ႇတိၼ်း ၵူၼ်း ၶွင် UniProt ဢၼ်လႆႈ လူင်းမႃး မိူဝ်ႈလိူၼ်သႅပ်ႇထႅမ်ႇပႃႇ 2018 ၼၼ်ႉသေ ၼႂ်းၵၢၼ်ထတ်းသၢင်ၼၼ်ႉ ပႃးဝႆႉ လွင်ႈမႄးၵႄႈ လွင်ႈမူတ်းသႂ် ဢၢႆႇသူဝ်ႇတူဝ်ႇ ဢၼ် ၽူႈႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ပၼ်ဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း limma ၼႂ်း R တွၼ်ႈတႃႇ လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈၼႄလွင်ႈပႅၵ်ႇပိူင်ႈ။ ၶေႃႈမုၼ်းငဝ်ႈတိုၼ်း၊ ၶေႃႈတွပ်ႇ ၵၢၼ်သွၵ်ႈႁႃ ၶေႃႈမုၼ်း လႄႈ လွင်ႈႁဵတ်းၵၢၼ် ၵၢၼ်ထတ်းသၢင် ၶေႃႈမုၼ်း လႄႈ ၶေႃႈတွပ်ႇ ၸိူဝ်းၼႆႉ တင်းမူတ်း သိမ်းဝႆႉ တီႈၼႂ်း ၸုမ်းဢူၺ်းလီ ProteomeXchange လူၺ်ႈ ႁူင်းသိမ်းၶေႃႈမုၼ်း ၽူႈႁူမ်ႈၼႃႈၵၢၼ် PRIDE ဢၼ်မီး ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈ PXD019690 ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
ၶေႃႈမၢႆတွင်း ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်းလႆႈၼၼ်ႉ ႁဵတ်းႁႂ်ႈ လွင်ႈထတ်းသၢင် ၶိုၼ်ႈယႂ်ႇမႃး။ ၶိူင်ႈထတ်းသၢင် သဵၼ်ႈတၢင်း တၢင်းႁူႉ (QIAGEN) ၼႆႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း တႃႇတႅပ်းတတ်း လွင်ႈမၢၵ်ႈမီး ၶေႃႈၵႂၢမ်း ၶေႃႈမၢႆတွင်း ဢၼ်ႁဵတ်းၵၢၼ် ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်လႆႈ ၵဵပ်းဝႆႉ မိူဝ်ႈ 8 ဝူင်ႈၼၼ်ႉ (ႁၢင်ႈ 1)။ ၼႂ်းၵႅပ်ႈမၼ်း သဵၼ်ႈမၢႆ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်မီးၼမ်ႉၼၵ်း ဢၼ်လႆႈမႃးတီႈ ၵၢၼ်ထတ်းသၢင် ၶေႃႈမုၼ်း LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) ၼၼ်ႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်းၸွမ်း ပိူင်တႅၵ်ႈ ၶိူင်ႈထတ်း ဢၼ်မီးပႃႈတႂ်ႈၼႆႉ- Mus musculus ၼႆႉ လႆႈလိူၵ်ႈဝႆႉ ႁႂ်ႈပဵၼ် ၸိူဝ်ႉၽၼ်း လႄႈ ပိုၼ်ႉလင်သေ ၸၼ်ႉထၢၼ်ႈၼၼ်ႉ ၼႄဝႆႉ ၵႃႊၶၼ် P ဢၼ် Benjamini မူၼ်ႉမႄးဝႆႉ တႃႇ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇ 0.05 ဢမ်ႇၼၼ် တႅမ်ႇလိူဝ်ၼၼ်ႉ လႆႈဝူၼ်ႉဝႃႈ ပဵၼ်လွင်ႈထၢင်ႇၸႅင်ႈ။ တွၼ်ႈတႃႇ ႁၢင်ႈၽၢင်ဢၼ်ၼႆႉ ၼႄဝႆႉ မဵဝ်းသႅၼ်း ဢၼ်လိူဝ် ဢၼ်မီးၼိူဝ်သုတ်း ႁႃႈဢၼ် ၼႂ်းၵွင်ၵူႈၸုမ်း ဢၼ်ဢိင်ၼိူဝ် ၵႃႈၶၼ် P ဢၼ်လႆႈမႄးဝႆႉၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်း t-test လၢႆလၢႆဢၼ်သေ ၸႂ်ႉတိုဝ်း ပရူဝ်ႇၵရႅမ်ႇ ဢၼ်ပၼ်ႁႅင်း သွင်ၶၵ်ႉတွၼ်ႈ ၶွင် Benjamini, Krieger, လႄႈ Yekutieli (Q = 5%) ၼၼ်ႉသေ လွင်ႈထတ်းသၢင် လွင်ႈထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်ၸွမ်းၶၢဝ်းယၢမ်းၼၼ်ႉ လႆႈႁဵတ်းသၢင်ႈၼိူဝ် ၽူႈတႅၼ်းၽွင်း ဢၼ်လမ်ႇလွင်ႈ ဢၼ်မၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ ၼႂ်းသႅၼ်းၽႂ်မၼ်းၼၼ်ႉသေ ထႅဝ်လႂ်ထႅဝ်ၼၼ်ႉ လႆႈထတ်းသၢင် ႁင်းၽႂ်ႁင်းမၼ်းယဝ်ႉ။ ဢမ်ႇလူဝ်ႇဢဝ် SD ဢၼ်မၼ်ႈၵိုမ်း။
ၼင်ႇႁိုဝ် တေၸၢင်ႈဢဝ် ၶေႃႈတွပ်ႇ ဢၼ်လႆႈမႃးတီႈ ၵၢၼ်လဵပ်ႈႁဵၼ်းၼႆႉ မႃးၼိူင်းၵၼ်တင်း ၶေႃႈမုၼ်း ဢၼ်ပိုၼ်ၽႄဢွၵ်ႇမႃးၼၼ်ႉသေ ႁဵတ်းဢွၵ်ႇလႆႈ ႁၢင်ႈၽၢင် Venn ဢၼ်မီးၼႂ်း ႁၢင်ႈၽၢင် 1 ၼၼ်ႉ ႁဝ်းၶႃႈ လႆႈဢဝ် သဵၼ်ႈမၢႆ ထၢတ်ႈပရူဝ်ႇတိၼ်း ဢၼ်မီး တၢင်းၼမ်ၼၼ်ႉ မႃးႁူမ်ႈၵၼ်တင်း ၶေႃႈမၢႆတွင်း MitoCarta 2.0 (24) ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။ ၸႂ်ႉတိုဝ်းၶိူင်ႈမိုဝ်းထိုဝ် ဢၼ်မီးၼိူဝ်ဢွၼ်ႊလၢႆႊ ဢၼ်ပဵၼ် Draw Venn Diagram (http) သေ ႁဵတ်းဢွၵ်ႇ ႁၢင်ႈၽၢင်ၼၼ်ႉတႃႉ။
တႃႇတေႁူႉလွင်ႈ လၢႆးႁဵတ်းလၢႆးသၢင်ႈ ၽၢႆႇသဵၼ်ႈမၢႆ ဢၼ်ၸႂ်ႉတိုဝ်း တႃႇထတ်းသၢင် ပရူဝ်ႇတိၼ်းၼၼ်ႉ ၶႅၼ်းတေႃႈ တူၺ်းတီႈ တွၼ်ႈ ဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ် တင်း ၶူဝ်းၶွင် လႄႈ လွၵ်းလၢႆးၼၼ်ႉလႄႈ။ တွၼ်ႈတႃႇလွင်ႈၸၢမ်းတူၺ်းတၢင်ႇဢၼ်တင်းမူတ်းၼၼ်ႉ ၶေႃႈမုၼ်းႁူဝ်ယွႆႈမၼ်း တေလႆႈႁၼ်ၼႂ်း ဢပုမ်ႇဢၼ်ၵွင်ႉၵၢႆႇၵၼ်ၼၼ်ႉယူႇ။ သင်ဝႃႈ ဢမ်ႇလႆႈမၵ်းမၼ်ႈဝႆႉ တၢင်ႇလွင်ႈၼႆၸိုင် ၶေႃႈမုၼ်းတင်းမူတ်းၼႆႉ လႆႈၼႄဝႆႉ မိူၼ်ၼင်ႇ ၽတ်ႉၽဵင်ႇ ± SEM သေ လွင်ႈထတ်းသၢင် သဵၼ်ႈမၢႆတင်းမူတ်းၼၼ်ႉ လႆႈၸႂ်ႉတိုဝ်း ၶိူင်ႈၸၢၵ်ႈ GraphPad Prism 8.1.2 သေ ႁဵတ်းသၢင်ႈမႃးယဝ်ႉ။
တႃႇၶေႃႈမုၼ်းၽိူမ်ႉထႅမ် တႃႇလိၵ်ႈပိုတ်ႇၼႆႉ တူၺ်းလႆႈတီႈ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ။
ၼႆႉပဵၼ် လိၵ်ႈပိုတ်ႇၽုၺ်ႇ ဢၼ်ပိုၼ်ၽႄ ၸွမ်းၼင်ႇ ၶေႃႈမၵ်းမၼ်ႈ ၶွင် Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ဢၼ်ပၼ်ၶႂၢင်ႉ တႃႇၸႂ်ႉတိုဝ်း၊ ၽိုၼ်ဢိင်ႈ.
မၢႆတွင်း - ႁဝ်းၶႃႈ ယွၼ်းႁႂ်ႈၸဝ်ႈၵဝ်ႇ ပၼ် ဢီးမေးလ် ၸဝ်ႈၵဝ်ႇ ၼင်ႇႁိုဝ် ၵူၼ်းဢၼ်ၸဝ်ႈၵဝ်ႇ ပၼ်တၢင်းႁၼ်ထိုင် တီႈၼႃႈလိၵ်ႈၼၼ်ႉ တေႁူႉဝႃႈ ၸဝ်ႈၵဝ်ႇ ၶႂ်ႈႁႂ်ႈၶဝ် ႁၼ် ဢီးမေးလ်ၼၼ်ႉ လႄႈ ဢမ်ႇၸႂ်ႈ ဢီးမေးလ် ဢၼ်ဢမ်ႇလီၼၼ်ႉၵွႆး။ ႁဝ်းၶႃႈတေဢမ်ႇၵဵပ်းဢဝ် ဢီးမေးလ်သင်။
ၶေႃႈထၢမ်ဢၼ်ၼႆႉ ၸႂ်ႉတိုဝ်းတႃႇထတ်းတူၺ်းဝႃႈ ၸဝ်ႈၵဝ်ႇပဵၼ်ၽူႈမႃးဢႅဝ်ႇလႄႇႁိုဝ် လႄႈ ႁႄႉၵင်ႈလွင်ႈသူင်ႇလိၵ်ႈ spam လူၺ်ႈလၢႆးဢွမ်လူမ်း။
လူၺ်ႈ E. Motori ၊ I. ဢႃႇတၼႃႇသွပ်ႉ ၊ SMV ၶူဝ်ႇၶႅၼ်ႇ ၊ K. ၾူဝ်းၸ်-တူဝ်ႇၼႃႇႁူႇ ၊ V. သႅၵ်ႉသီႇဝႄႇလူဝ်ႇ ၊ လႃႇသၼ်ႇ
လွင်ႈထတ်းၸႅတ်ႈ Proteomics ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈၼၼ်ႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ ပရူဝ်ႇၵရႅမ်ႇ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼႆႉ တူင်ႉၼိုင် တႃႇတေ ၶႄႉၶဵင်ႇတေႃႇ လွင်ႈဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ လူႉလႅဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
လူၺ်ႈ E. Motori ၊ I. ဢႃႇတၼႃႇသွပ်ႉ ၊ SMV ၶူဝ်ႇၶႅၼ်ႇ ၊ K. ၾူဝ်းၸ်-တူဝ်ႇၼႃႇႁူႇ ၊ V. သႅၵ်ႉသီႇဝႄႇလူဝ်ႇ ၊ လႃႇသၼ်ႇ
လွင်ႈထတ်းၸႅတ်ႈ Proteomics ၶွင် ဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ ဢၼ်ဢမ်ႇႁဵတ်းၵၢၼ်လႆႈၼၼ်ႉ ၼေဝႆႉဝႃႈ ပရူဝ်ႇၵရႅမ်ႇ ၵၢၼ်လႅၵ်ႈလၢႆႊထၢတ်ႈ ၼႆႉ တူင်ႉၼိုင် တႃႇတေ ၶႄႉၶဵင်ႇတေႃႇ လွင်ႈဢဵၼ်ဢႃႇရူင်ႇ လူႉလႅဝ်ၼၼ်ႉယဝ်ႉ။
©2020 ၸုမ်းဢမေႇရိၵၢၼ်ႇ တႃႇၶိုၼ်ႈယႂ်ႇပၢႆးသၢႆႊ။ သုၼ်ႇလႆႈသုၼ်ႇပဵၼ်ၵူႈလွင်ႈလွင်ႈ။ AAAS ၼႆႉ ပဵၼ်ၽူႈႁူမ်ႈၼႃႈၵၢၼ် ၸုမ်း HINARI ၊AGORA ၊OARE ၊CHORUS ၊CLOCKSS ၊ လွင်ႈၶိုၼ်ႈယႂ်ႇပၢႆးသၢႆႊ ISSN 2375-2548။